تعيين اولويتها و چارچوبهاي استفاده از فناوري سلولهاي بنيادي در حوزه علوم و فناوريهاي شناختي

Transcript

1 تعيين اولويتها و چارچوبهاي استفاده از فناوري سلولهاي بنيادي در حوزه علوم و فناوريهاي شناختي 1 و 2 2 مجريان: دکتر محمد جوان دکتر حسين بهاروند 1 همکاران: دکتر ساره اسدي 3 دکتر علي فتحي - 2 دکتر سمانه دهقان دانشگاه تربيت مدرس- گروه فيزيولوژي- آزمايشگاه ترميم سيستم عصبي پژوهشگاه رويان- پژوهشکده علوم سلولي گروه زيست شناسي تکويني و سلولهاي بنيادي دانشگاه علوم پزشکي شهيد بهشتي- مرکز تحقيقات نوروبيولوژي آدرس مکاتبه: mjavan@modares.ac.ir )محمد جوان( 1

2 فهرست مطالب چکيده و خالصه فرايند هاي اجرايي:... 3 مقدمه پايش گرنت هاي پژوهشي مرتبط با بيماريهاي شناختي نگاهي به ميزان بودجه هاي اختصاص يافته: مهمترين پروژه هاي NIH در خصوص کاربرد سلولهاي بنيادي در بيماريهاي داراي عوارض شناختي فناورانه تمايزي منابع سلولي براي استفاده در سلول درماني يا کاربردهاي 1-4- انواع سلول بنيادي بر اساس توانايي 2-4- انواع سلول بنيادي بر اساس بر اساس منشاء سلول درماني در بيماريهاي نورودژنراتيو بيماري پارکينسون بيماري ام. سا بيماري آلزايمر بيماري هانتينگتون جمع بندي سلول درماني بيماري هاي نورودژنراتيو محققين اير يان در توليد و کاربرد سلولهاي بنيادي در بيماريه يا نورودژنراتيو توانمندي ه يا 4- کاربردهاي فناورانه سلولهاي بنيادي در علوم شناختي کاربرد در تکنولوژي ميکروفلوئيدي براي مطالعات علوم اعصاب شناختي کاربرد در مهندسي رفتار و کنترل ذهن برنامه کنترل ذهن سازمان... CIA پروژه...)Defense Advanced Research Projects Agency( DARPA فناوري اپتوژنتيک و کنترل مغز با نور توليد پروتزهاي عصبي و کنترل عصبي پروتزهاي ساير اندامها اولويت هاي پيشنهادي براي استفاده از سلولهاي بنيادي در حوزه علوم شناختي

3 1- چکيده و خالصه فرايند هاي اجرايي: شناخت حافظه و هوشيا ير مفاهيمي هستند که با زندگي انسان عجين شده و از زندگي انساني تفکيک ناپذيرند. بررسي اين مفاهيم با کمک تکنولوژي و استفاده از حيوانات مدل سبب شناخت بيشتر ما از نحوه کارکرد سيستم عصبي در انسان ميشود. پيشرفت هاي اخير در زمينه سلوله يا سبب بنيادي پديد آمدن زواياي جديدي در مطالعه نحوه کارکرد سيستم عصبي از طريق دستورزي پيوند و رديا يب اين سلولها فراهم نموده است و اميدي جهت درمان بيماريه يا مرتبط فراهم آورده است. بيماريهاي تحليل برنده دستگاه عصبي )نورودژنراتيو( با از دست رفتن نورونها اليگودندروسيتها آستروسيتها آکسونها و ساير ارتباطات سلولي همراه هستند. با تحليل اجزاي سيستم عصبي فرد عملکردهاي عصبي از جمله اعمال شناختي نيز تحت تاثير قرار گرفته و دچار نقص ميگردد. عليرغم هزينههاي زياد درماني در اغلب موارد درمانهاي فعلي موثر نيستند و در نهايت با پيشرفت بيماري ناتواني و مرگ حادث ميشود.با فراهم آمدن مقدمات درمانهاي سلولي غنيسازي محيط عصبي براي حفاظت از سلولهاي در معرض خطر و تقويت ترميم درونزاد و همچنين جايگزيني سلولهاي از دست رفته با سلولهاي پيوندي در مرکز توجه درمانهاي جديد قرار گرفته است. راهبرد جايگزيني سلولها در پي يافتن سلول متناسب با پاتوبيولوژي بيماري و يا توليد آزمايشگاهي آن است. هدف اين مطالعه تعيين اولويتها و چارچوبهاي استفاده از فناوري سلولهاي بنيادي در حوزه علوم و فناوريهاي شناختي است. مهمترين فعاليت هاي انجام شده در اين پژوهش عبارتند از: سيستم عصبي طرحه يا تحقيقاتي و گرانته يا در دنيا پژوهشي 1- در ابتدا فهرستي از بيماريه يا که به اين امر اختصاص داده شده ارائه شده است. در ادامه به صورت اختصاصي به سهم مطالعات مرتبط با سلولهاي بنيادي در زمينه هريک از -2 بيماريه يا مرتبط به شناخت و درمان اشاره شده است. 3

4 به مهمترين مطالعات و توانمندي ه يا موجود در جهان در تحقيق و کارآزمايي در مورد باليني -3 چند بيماري شاخص پرداخته و به امکان استفاده از انواع سلولهاي براي بنيادي هر کدام با توجه به پاتولوژي بيماري بررسي شده است. بررسي ها نشان مي دهد مطالعات پايه نسبتا خوبي در کشور در زمينه انواع سلولهاي توليد -4 بنيادي ( پرتوان جنيني پرتوان القايي دگرتمايزي سلول مزانشيمي کشت در بيوراکتور و اسپينر فالسک توليد براي انبوه( و سلول درماني انجام شده است و توانايي پيشنهادي ه يا اولويت براي داخلي علمي گلوگاه نيست. 5- در پايان به امکان کاربردهاي فناورانه سلوله يا بنيادي در حوزه شناخت اشاره شده است. برخي فناوري ه يا حوزه علوم اعصاب مورد بررسي قرار گرفته و با توجه به توان به کارگيري سلولهاي بنيادي در اين فناوريها امکان ايجاد فرصت هاي مطالعاتي و کاربردي با هر فناوري طرح شده است. 1- در پايان برخي از بخشهاي مطالعه تحليلي در خصوص استفاده در سلول درماني و يا اولويت نوع سلول و سطح مطالعه مورد حمايت ارائه شده است. از تجميع اين تحليلها و برخي جمع بندي ه يا نهايي اولويت هاي مطالعاتي پيشنهاد شده است. با توجه به محدوديت منابع مالي ميزان پيشرفت در شناخت پاتوبيولوژي هر بيماري ميزان -4 نزديکي دانش روز به کاربرد و توانمندي انواع سلولهاي موجود و همچنين توانايي شده سعي داخلي ه يا اولويت هاي مورد حمايت در پژوهشهاي مرتبط با کاربرد سلولهاي در درمانهاي بنيادي و شناختي مطالعات مکانيستيک پيشنهاد شود. اميد است اين مطالعه بتواند به عنوان راهنماي تعيين اولويت تحقيقات حاضر و آينده در زمينه کاربرد سلوله يا بنيادي در عرصه علوم شناختي براي محققان و مراکز عالقهمند مورد استفاده قرار گيرد. 4

5 2- مقدمه به طور طبيعي با افزايش سن شناخت (Cognition) افراد دچار اختالل ميشود Cognitive(.)impairment اين واقعه تقريبا در اغلب افراد رخ داده و جنبههاي مختلف زندگي را تحت تاثير قرار ميدهد. کاهش شناخت ميتواند به علت برخي از فرايند هاي دژنراتيو در مغز رخ دهد. از طرف ديگر بسياري از بيماريهاي سيستم عصبي نيز داراي جنبههاي شناختي ميباشند و کنترل اين بيماريها بدون مطالعه دقيق فرايندهاي شناختي اختالالت شناختي و پيشرفتهاي علم در اين حوزه ممکن نيست. همچنين تحقيقات علمي مي تواند در برخي موارد از بيماريها جلوگيري نمايد يا حداقل آن را پيش بيني و محدود کند. در بافتهاي مختلف بدن از جمله در سيستم عصبي سلولها به طور مداوم و تدريجي از دست مي- روند و با سلولهاي جديد جايگزين ميشوند. لذا از دست رفتن سلولها و جايگزيني آنها يک فرآيند طبيعي است که منجر به نوسازي بافتها و اندامها ميگردد. توليد سلولهاي جديد با کمک سلولهاي پيش ساز و بنيادي هر بافت صورت ميگيرد. به سلولي بنيادي سلول اطالق ميگردد که توانايي تقسيم و تبديل به انواع ردهه يا را دارا سلولي است. سلوله يا بنيادي خود به انواع مختلفي تقسيم ميشوند که از نظر توانايي و قدرت تکثير و تمايز با يکديگر متفاوتند. سلوله يا بنيادي همهتوان (Totipotent) قادرند کليه سلولها و بافتها را توليد کرده پرتوان (Pluripotent) يک و در نهايت موجود کامل را بسازند. سلوله يا بنيادي توانايي محدودتري يع ين دارند ميتوانند به هر نوع سلول تبديل شوند اما قادر به ساختن جفت نيستند. سلوله يا بنيادي چندتوان (Multipotent) جنيني از اين دسته هستند. بيشتر سلوله يا بنيادي بالغ در دسته سلوله يا in vivo قرار ميگيرند. اين سلولها را عمدتا با بافتي که از آن استخراج شدهاند يا به صورت در آنجا ديده شدهاند ميشناسند. اين سلولها توانايي تبديل به انواع سلوله يا همان بافت را دارند ]14[. 5

6 چنانچه فرآيند حذف سلولهاي بافت بر توليد سلولهاي جديد غلبه نمايد بافت به تدريج تحليل خواهد رفت. اين اتفاق به صورت طبيعي در طي فرآيند پير شدن بروز ميکند که در نتيجه کاهش جمعيت سلولهاي بنيادي پيش ساز در بافتها و کاهش توان تمايز آنان حاصل ميشود. در برخي شرايط فرآيند حذف سلول به صورت بيمار گونه بر فرآيند توليد آن پيشي ميگيرد و باعث ايجاد بيماريهاي دژنراتيو ميگردد. چنانچه اين اتفاق در بافت عصبي بيفتد باعث ايجاد بيماريهاي نورودژنراتيو ميگردد. از دست رفتن سلولهاي عصبي ميتواند به علل مختلف )ژنتيکي محيطي ضربات و...( و در مکانهاي مختلف اين دستگاه صورت گيرد. بسته به اينکه بخش تحليل رفته سيستم عصبي چه عملکردي در فرد داشته باشد و روند تحليل با چه سرعتي و چه مکانيزمي پيش رود عوارض بيماري و پيامدهاي آن متفاوت است. گاهي از دست رفتن سلولها در نتيجه ضربات و يا قطع جريان خود بافت به صورت حاد و دسته جمعي بروز ميکند. ضايعات نخاعي ضربات مغزي ايسکميهاي مغزي و قلبي از جمله علل اينگونه آسيبهاي مغزي هستند. خط اول درمان در تمام بيماريهاي نورودژنراتيو که منجر به نقص شناختي ميشود جلوگيري از تحليل بافت و مرگ سلولهاست. اما اين روند در بيشتر موارد قابل توقف نيست و بيماري به تدريج )بسته به ميزان تاثير درمان( و با سرعتهاي مختلف پيشرفت مينمايد و بيمار را ناتوان از فعاليت هاي شغلي و اجتماعي و در مراحل بعدي ناتوان از فعاليت هاي روزمره و شخصي مينمايد. برخي از درمانهاي امروزي نيز سعي در کنترل عالمتهاي بيماري و بهبود ناتوانيها دارند )عالمت درماني(. بنابراين به نظر ميرسد که در کنار درمان هاي پيش گيري کننده روشه يا درماني که بتواند سلولهاي از دست رفته و در نتيجه کار کرد از دست رفته را به صورت کامل يا حتي نسبي برگرداند مورد نياز است. همانطور که گفته شد در حالت طبيعي حذف سلولهاي بافتها از جمله بافت عصبي با کمک سلولهاي پيش ساز و بنيادي بافت جبران ميشود. لذا به نظر ميرسد براي جايگزيني سلولهاي از دست رفته در بيماريهاي 1

7 مختلف که منجر به نقص عملکردهاي شناختي افراد ميگردد نيز بتوان از سلولهاي بنيادي و يا سلول- هاي پيش ساز توليد شده از آنها کمک گرفت. بيماريهاي نورودژنراتيو بار مالي و خسارات اجتماعي زيادي را بر جوامع بشري تحميل نموده است. در جامعه آمريکا به عنوان جامعهاي که آمار نسبتا جامعي در خصوص بيماريهاي مختلف و هزينههاي آن دارد بيش از 8 ميليون نفر از بيماريهاي آلزايمر هانتينگتون پارکينسون ALS آتروفي نخاعي- عضالني) SMA ( و بيماري ام اس )MS( رنج ميبرند ]1[. آمار دقيقي از ميزان ابتالي افرد به بيماريه يا مذکور در ايران در دسترس نيست و به نظر مي رسد با ميانگين جهاني تفاوت چنداني نداشته باشد. در عين حال بر اساس برخي اطالعات پراکنده ارائه شده از سوي انجمن هاي تخصصي و مراجع درماني سعي.)1 شده است برآوردي از ميزان ابتال ارائه شود )جدول انستيتو ملي سالمت )NIH( آمريکا در سال براي تحقيقات در زمينه اين شش بيماري بيش از 841 ميليون دالر هزينه نموده است ]1[ و اين 2111 ميزان بدون تغيير قابل توجهي در سالهاي 2112 و 2113 نيز هزينه شده است.( سهم هر بيماري تقريبا متناسب با ميزان شيوع آن در جامعه بوده است. عليرغم هزينههاي زياد و اثرات مالي- اجتماعي فراوان اين بيماريها هنوز درمانهاي قابل قبولي در دسترس نميباشند. آناليز مقاالت منتشر شده در زمينه هر کدام از اين بيماريها نشان ميدهد که حدود 2 درصد مقاالت به نوعي کاربرد سلولهاي بنيادي را توصيه مينمايند. آماري که با دسترسي به منابع متنوعتر سلولهاي بنيادي در حال افزايش است به طوريکه در پنج سال اخير حدودا دو برابر شده است. شايد اگر قوانين سخت گيرانه کشورهايي مانند آمريکا براي استفاده از سلول درماني نبود اين آمار بسيار متفاوت بود. نکته جالب توجه اينکه قوانين سخت گيرانه آمريکا براي کاربرد سلولهاي بنيادي در درمان برخي از افراد مبتال را براي سلول درماني روانه کشورهايي مانند چين و هند نموده است. لذا به نظر ميرسد عدم توجه کافي به سلول درماني و تاخير در استاندارد 4

8 سازي آن لزوما به معني عدم دسترسي افراد به اين درمان نخواهد بود بلکه ممکن است آنها را به سمت درمان در کشورهايي سوق دهد که در آنها مطالعات پايه و باليني جامعي رخ نداده و دستورالعمل هاي استاندارد تدوين نشده است. اين اتفاق عالوه بر مخاطرات زياد براي بيماران به هدر رفت منابع نيز منجر خواهد شد. با توجه به موارد فوق به نظر ميرسد حرکت به سوي استفاده وسيعتر همراه با تعريف استانداردهاي مشخص براي سلول درماني در بيماريه يا شناختي امري گريز ناپذير است. جدول 1- ميزان شيوع برخي بيماري هاي نورودژنراتيو داراي اختالالت شناختي در ايران بيماري ام.اس. آلزايمر هانتينگتون ميزان شيوع در تهران و اصفهان 44 تا 111 نفر در هر 111 هزار نفر مبتال به ام اس هستند- ميزان ابتال در خانم ها دوبرابر آقايان- سن ابتال بين 21 تا 41 سال بيش از 411 هزار نفر در ايران به آلزايمر مبتال هستند يک نفر از هر نفر- بيماري ژنتيکي غالب- بروز عالئم بيماري از سن 31 سالگي )حدود 4511 نفر در کشور( ALS پارکينسون هستند بيش از 3 هزار نفر مبتال به اين بيماري بين 111 تا 311 نفر از هر 111 هزار نفر )بيش از 151 هزارنفر بيمار مبتال به پارکينسون در کشور( منبع سايت وزارت بهداشت سايت انجمن آلزايمر در ايران سايت ژنتيک پزشکي سايت ايران سالمت سايت ايران سالمت 3- پايش گرنت ه يا پژوهشي مرتبط با بيماريهاي شناختي بزرگ جهاني در زمينه بيماريهاي 1-3- نگاهي به ميزان بودجه هاي اختصاص يافته: در اين مطالعه براي ارزيابي ميزان سرمايه گذاري سازمانهاي شناختي و سلولهاي بنيادي ميزان گرانتهاي اعطايي از سوي NIH (National institute of مورد بررسي قرار گرفته است. انستيتو NIH آمريکا در يکي از زير مجموعههاي خود بنام health) 8

9 (National Institute for mental health) انستيتو ملي مطالعات سالمت روان يا NIMH مطالعات گستردهاي در زمينه بيماريهايي که به نحوي باعث اختالل در شناخت ميشوند انجام ميدهد و هر ساله مبالغ زيادي در راستاي پروژههاي تحقيقاتي وابسته به سالمت روان با اميد به افزايش کيفيت NIMH زندگي افراد صرف ميکند. يکسري از پروژههاي مصوب در مربوط به استفاده از سلولهاي 151 ميليارد دالر صرف پروژهاي تحقيقاتي در زمينه- بنيادي در علوم شناختي ميباشد. در سالهاي اخير موسسه NIH ساالنه حدود هاي مختلف علوم مرتبط با سالمت افراد نموده است. همانطور که در جدول 1 مشاهده ميشود در سال 2113 از اين ميزان حدود 14 ميليارد دالر صرف پروژههايي شده که مرتبط با بيماريهايي است که داراي 41 جنبههاي شناختي هستند. از اين مبلغ ساالنه حدود 51 تا ميليون دالر صرف تحقيقات استفاده از سلولهاي بنيادي در اين بيماريها شده است. در اين پروژهها از انواع سلولهاي بنيادي در زمينه مطالعه و درمان بيماريهاي شناختي استفاده شده است )جدولهاي 2 و 3(. 3

10 جدول 2 - بودجه تخصيص داده شده توسط NIH.2212 به بيست بيماري شايع با اختالالت شناختي در سالهاي 2212 تا 11

11 جدول 3 - سهم بودجه پژوهش هاي مرتبط با کاربرد سلولهاي بنيادي در بيست بيماري شايع داراي عوارض شناحتي در سالهاي 2212 تا 2212 * اين ارقام مبالغ پرداخت شده براي توسعه مباني پايه سلولهاي بنيادي را شامل نمي شود و تنها مواردي در آن لحاظ شده که هزينه براي استفاده سلول بنيادي در آن بيماري پرداخت شده است. در بخش ديگري از حمايتهاي NIH ميتوان به تحقيقات در زمينه سلولهاي بنيادي اشاره کرد. از ديدگاه تحقيقات سلوله يا بنيادي ساالنه نزديک به ميليارد و ميليون دالر صرف تحقيقات در 41 اين زمينه ميشود که تقريبا 51 تا ميليون دالر آن مستقيما در زمينه سلول درماني بيماريهاي 11

12 شناختي است. تحقيقات سلولهاي بنيادي بيشتر در مرحله اوليه توسعه زير ساختها و توليد انواع سلول- هاي بنيادي است و هنوز وارد فاز استفاده در بيماريها نشده است مهمترين پروژه هاي NIH در خصوص کاربرد سلولهاي بنيادي در بيماريه يا داراي عوارض شناختي از ميان هزينههاي تخصيص داده شده در زمينه سلولهاي بنيادي و بيماريهايي شناختي نزديک به ده پروژه با گرانت باالي 511 شده است. هزار دالر در سال وجود داشت که خالصهاي از اين پروژهها در زير آورده در پروژهاي با هدف جستجوي اثرات ژنوميک و اپي ژنوميک تعداد کپيهاي يک ژن در نورونهاي به دست آمده از سلولهاي پرتوان ساالنه مبلغ دو ميليون 235 دالر اختصاص هزار يافته تا بتوانند به اين سوال که تعداد کپي يک ژن چه اثري بر تغييرات ايجاد شده در يک نورون و ايجاد بيماريهاي وابسته به آن دارد پاسخ دهند. براي مثال در بيماري مانند اسکيزوفرني و يا اوتيسم تعداد کپيهاي يک ژن چه اثري بر روند بيماري دارد تا با تغيير آن بتوان به سدهاي موجود در بيماري فايق آمد و راهکارهايي براي درمان پيدا کرد. در پروژه ديگري هدف توليد سلولهاي ips از فيبروبالست افراد داراي بيماري Autism با استفاده از فاکتورهاي نسخه برداري بود. سلولهاي پرتوان ايجاد شده به سلولهاي بنيادي عصبي تبديل شده و تفاوت آنها با سلوله يا بنيادي عصبي توليد شده از فيبروبالسته يا افراد سالم بررسي گرديده است. با استفاده از اين سلولها اثر عوامل مختلف از جمله عوامل محيطي و ژنتيکي در بروز اين بيماري مطالعه شده و نوروژنز در افراد داراي اين بيماري بررسي شده است. از سال 2111 به اين پروژه دالر به صورت ساالنه اختصاص داده شده است. 12

13 در يک مطالعه ديگر سلولهاي پرتوان را از سلولهاي فيبروبالست افراد دچار بيماري هانتينگتون استخراج کرده و سپس اين سلولها را به سلولهاي گليالي و نوروني تبديل کردند و ضمن پي بردن به نقصهاي ژنتيکي در اين افراد سعي در يافتن داروهاي مناسب براي درمان اين بيماري داشتهاند. اين پروژه 111 هزار دالر از NIH بودجه دريافت کرده است. بيماري هايي مانند اسکيزوفرني ميتوانند از طريق اسپرم داراي جهش ژنتيکي از پدران پير به فرزندان منتقل گردد لذا در يک پروژهاي ديگر با دريافت ساالنه 251 هزار دالر بودجه از NIH از سلول- هاي اسپرماتوگوني پدران پير به منظور بررسي جهش و پي بردن به مکانيزم اين بيماري و ساير بيمارهايي از اين قبيل که در نتيجه جهش در ساختار ژنتيکي اسپرم از پدر به فرزند منتقل ميشود استفاده کردند تا به نقش جهش در ايجاد اين بيماريها پي ببرند. در يک مطالعه بودجه دريافتي به ميزان يک ميليون و دويست هزار دالر در سال اول و دو ميليون دالر در سال دوم صرف پروژهاي گرديد که در آن توليد نورونهاي دوپامينرژيک از سلولهاي بنيادي القايي انجام مي شود. هدف اين پژوهش در ابتدا توليد سلولهاي ips است و سپس با کشت همزمان اين سلول- ها با سلولهاي استرياتوم روند تمايز اين سلولها را به نورونهاي دوپامينرژيک بررسي ميکنند. در اين راستا عالوه بر سلولهاي ips از سلولهاي بنيادي جنين ESC هم استفاده ميگردد و به دنبال يافتن فاکتورهاي رشد و ساير عواملي هستند که باعث تمايز اين دو گروه به نورونهاي دوپامينرژيک ميشوند و سپس با توليد اين نورونها از ips بدست آمده از افراد بيمار به دنبال جستجوي تغيير در تعداد کپيهاي يک ژن و اثر آنها بر ايجاد بيماريهاي وابسته به اين نورونهاست. ips در مطالعهاي ديگر ششصد هزار دالر دريافتي از NIH صرف مطالعه بر روي سلولهاي و يا که ژن PTEN سلولهاي ESC به طور مهندسي در آنها حذف شده است گرديد تا بتوانند نقش اين پروتئين را در نورونهاي دوپامينرژيک بررسي کنند و پس از توليد سلولهاي فاقد ژن PTEN و پيوند 13

14 آنها به موشهاي داراي بيماري پارکينسون نقش حفاظتي اين سلولها در مسيرهاي سيگنالينگ سلولي افراد داراي بيماري پارکينسون مشخص گردد. جهت ايجاد يک پايگاه اينترنتي بيوانفورماتيک براي طراحي آناليز و مطالعات ژنتيکي در مورد بيماريهاي شناختي نيز بودجهاي حدود هشتصد هزار دالر اختصاص يافته است تا افراد و محققان بتوانند نتايج پژوهشهاي مختلف را به منظور بررسي آناليز و طراحي آزمايشهاي آتي در اختيار سايرين قرار دهند. 2- منابع سلولي براي استفاده در سلول درماني يا کاربردهاي فناورانه 1-2- انواع سلول بنيادي بر اساس توانايي تمايزي سلولهاي بنيادي cells( )stem داراي دو ويژگي اساسي يعني توانايي تقسيم شدن و توليد سلولهايي با خواص يکسان )خود نوزاييrenewal )self- و ايجاد انواع سلولهاي تمايز يافته هستند. بر اساس توان تمايزي سلولها را ميتوان به انواع ذيل تقسيم کرد: 1( همه توان) totipotent (: اين سلولها ميتوانند همه سلولها اعم از فرد و سلولهاي خارج جنيني)جفت( را بسازند مانند بالستومرهاي يک جنين دو سلولي که هر سلول آن ميتواند يک فرد کامل را بسازد. 2 (پرتوان :)pluripotent( سلولهايي هستند که ميتوانند غالب يا همة سلولهاي فرد را بسازند. مثال سلولهاي بنيادي جنيني تحت شرايط خاص ميتوانند يک فرد را بسازند ولي قادر به ايجاد سلولهاي خارج )جفت( جنيني نيستند. سلولهايي که از گنادهاي جنيني )fetus( بدست ميآيند و به آن سلولهاي نيز جزء اين دسته هستند )شکل 1(. زاينده جنيني ( EG )embryonic germ cells: گفته ميشود (embryonal carcinoma: EC) 14 سلولهاي تمايز نيافته کارسينوماي جنيني مشتق از

15 تراتوکارسينوماها نيز پرتوان هستند. تراتوکارسينوماها تومورهاي خوشخيم هستند که داراي جمعيتهاي تمايز نيافته زيادي ميباشند. مطالعات قبلي رخداد تراتوکارسينوما به صورت خود به خود را نشان دادند. اين سلولها قابليت تمايز در محيط آزمايشگاهي را دارند. تک تک اين سلولها قادر به تشکيل کلني هستند و با تمايز ميتوانند سه اليه زايندة جنيني )اکتودرم مزودرم و اندودرم( را به وجود آورند. سلول هاي بنيادي القايي ips) (induced pluripotent stem cells; که با القاي بيان نابجاي ژن هاي پرتواني از سلول هاي پيکري تمايز زدايي مي شوند نيز در اين رده دسته بندي مي شوند. 3( چند توان) multipotent (: تعداد محدودتري از انواع سلولي را ميتوانند ايجاد کنند. مانند سلولهاي بنيادي واقع در بافت هاي بزرگساالن و سلول هاي بنيادي مزانشيم و سلول هاي بنيادي رده خونساز. شکل 1: مقايسه منشاء سلولهاي پرتوان سلولهاي بنيادي جنيني )ES( سلولهاي کارسينوماي جنيني )EC( و سلولهاي زاينده جنيني ))EG(.( Wobus and Boheler

16 2-2- انواع سلول بنيادي بر اساس بر اساس منشاء )embryonic( به طور کلي سلولهاي بنيادي داراي منشاء مختلف شامل چند جنيني پرتوان القايي بازبرنامه ريزي شده مستقيم )در مورد ساخت پيشسازهاي چند يا تک توان از انواع سلول inner cell ( سوماتيک( و بزرگساالن) adult ( هستند. سلولهاي بنيادي جنيني از توده سلولي داخلي )mass جنين در مرحله بالستوسيست به دست ميآيند )شکل 1 (. دسته ديگر سلولهاي بنيادي بزرگساالن هستند که در بسياري از بافتهاي تخصص يافته بدن از جمله مغز مغز استخوان کبد پوست لوله گوارش قرينه و شبکيه چشم و حتي پالپ دندان يافت ميشوند قادرند به صورت )differentiation( و يا تمايز مستقيم انواع ديگري از سلولها نظير سلولهاي ماهيچه اسکلتي ميکروگليا و آستروگليا در مغز و هپاتوسيتهاي کبدي را بسازند. بر اساس اين مشاهدات پيشنهاد شده که ممکن است اين سلولها در طب پيوند کاربرد داشته باشند. اما دانشمندان ديگر در اين مورد شک دارند و نشان دادند که اين سلولهاي بنيادي با سلولهاي سوماتيک در هم ادغام ميشوند. گذشته از اين تکرار پذيري تمايز سلولهاي بنيادي مغز استخوان به بافت هاي غيرخوني کم ديده شده است. بنابراين به اين سئوال که آيا سلولهاي بنيادي بزرگساالن بويژه سلولهاي مزانشيمي سلولهاي پرتوان حقيقي هستند و قادر به تکثير نامحدود در محيط کشت هستند هنوز پاسخ مشخصي داده نشده است. سلولهاي پرتوان جنيني و ساير سلول هاي پرتوان از جمله سلولهاي پرتوان القايي داراي ويژگيهاي -1 کاربردي خاص خود هستند که عبارتند از: اين سلولها خاصيت ناميرايي )immortality( دارند که به صورت طبيعي و بدون ايجاد جهش ژني و يا آلودگي ويروسي اين حالت را از خود نشان ميدهند. 2- اين سلولها توانايي دارند که به انواع ردههاي سلولي متمايز شوند. 3- از اين سلولها به راحتي ميتوان در آزمايشات مربوط به دستکاري ژنتيکي استفاده نمود. 11

17 به همين دليل از سلولهاي پرتوان بويژه نوع جنيني در تحقيقات جديد مانند توليد و تمايز سلولهاي بنيادي جنيني به ردههاي خاص و سپس پيوند به بدن به عنوان سلول درماني) therapy )cell و نيز در توليد حيوانات ترانس ژنتيک animal( )transgenic استفاده ميبرد. ويژگي خاص سلولهاي پرتوان القايي امکان استفاده از آنها براي توليد سلول براي پيوند اتولوگ است. يعني سلول هر فردي را با بازبرنامه ريزي پرتوان نمود و از آن سلول مورد نظر را توليد نمود. اين نوع سلول يک موفقيت بزرگ در خصوص درمان سلولي بيماريهايي است که علت آن ها نقص ژنتيکي نيست. در مورد بيماريهاي داراي علت ژنتيکي کاربرد اين سلولها مستلزم بر طرف کردن نقص ژنتيکي و سپس تمايز و پيوند آنهاست. بعبارتي سلولهاي بدست آمده ابتدا بايد با ژن درماني شوند و پس از درمان ژني مورد استفاده درماني قرار گيرند. اگر بيماري در اثر موتاسيون در يک ژن باشد همانند فرم مغلوب در بيماري متابوليکي (LINCL) late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis و يا يکي از انواع پارکينسون که موتاسيون در ژن پارکين اتفاق ميافتد ميتوان از جايگزيني ژن سالم استفاده کرد هر چند که تا امروز مبناي ژنتيکي براي بسياري از بيماريهاي سيستم عصبي مشخص نشده است. برخالف اين بيماريها که ژن مربوطه بيان نميشود در برخي از بيماريها موتاسيون سبب شده که ميزان بيشتري از يک پروتئين توليد شود و يا ساختار پروتئين معيوب باشد و در داخل سلول تجمع پيدا کند که اين حالت را در بسياري از بيماريها همانند اجسام لوي bodies( )Lewy در بيماري پارکينسون پالک هاي آمينوئيدي و شبکه هاي درهم از فيبرهاي نووروني در آلزايمر و اجسام غير محلول در هانتينگتون ميتوان مشاهده کرد. ژن درماني يک شيوه درماني است که در آن ماده ژنتيکي به منظور جلوگيري از بيماري يا سرکوب آن به داخل سلول هاي فرد بيمار انتقال داده مي شود. ژندرماني همانگونه که ابتدا فکر ميشد به عنوان يک راهکار جهت درمان بيماريهايي که در اثر نقصهاي ژنتيکي پديد ميآيند با درج از يک نسخه ژن سالم به داخل سلولهاي سوماتيک ميتواند سبب بهبودي شود ]2[. اغلب بيماريهاي 14

18 تک ژني )مونوژنيک( سلولهاي خوني کانديدهاي خوبي براي ژندرماني هستند چرا که اين بيماريها به خوبي در سطح مولکولي شناخته شده هستند و سلولهاي هدفي که بايد مورد درمان قرار گيرند سلولهاي بنيادي رده خونساز هستند که قابليت دسترسي به آنها باال است و به راحتي در محيط آزمايشگاه ميتوان آنها را دستورزي کرد و دوباره پيوند زد ]3[. مزيت عمده ژندرماني در مقايسه با ساير روشها مثل پيوند سلولهاي بنيادي خونساز که از افراد دهنده سازگار گرفته شده است در اين است که ژندرماني از نظر تئوري براي تمامي بيماران قابل انجام است و همچنين مشکل رد پيوند را از بين ميبرد. سلوله يا بنيادي انواع مختلفي دارند. سلولهاي بنيادي جنيني توان توليد انواع سلولهاي بدن را دارند اما سلولهاي پيش ساز به تعداد محدودي سلول تمايز مييابند. به عنوان مثال سلولهاي پيش ساز عصبي) progenitors )Neural و يا سلولهاي بنيادي عصبي cells( ) Neural stem قابليت تبديل به سلولهاي رده عصبي را دارند. اين سلولها ممکن است از بافتهاي عصبي جنيني يا بالغين استخراج شوند يا از طريق تمايز هدف دار و آزمايشگاهي از سلولهااي بنياادي پرتاوان تولياد شاوند. پيشسازهاي عصبي هر چند در محيط کشت توان تکثير خوبي دارند اما پس از پيوند به فارد تکثيار خود را متوقف نمود و متماايز مايشاوند. سالولهاي بنياادي مزانشايمي ( stem Mesenchymal )cells منبع مناسب ديگري براي سلول درمانياند که توان تکثير خاوبي دارناد. هار چناد باه طاور طبيعي به استئوبالست کندروسيت و آديپوسيت متمايز ميشوند شاواهدي در دسات اسات کاه در محيط آزمايشگاهي به انواع ديگر سلولها از جمله سلولهاي بافت عصابي متماايز مايشاوند. امکاان پيوند اتولوگ اين سلولها تمايل به کاربرد آنها را زيادتر نموده است هر چند در مواردي که بيماري منشا ژنتيکي دارد اين نوع کاربرد کمتر مورد توجه خواهد بود. اين سلولها به علت کم خطار باودن پس از پيوند نيز به ميزان زيادي مورد توجه واقع شدهاند. گروه ديگري از سلولها کاه در طاي چناد سال اخير معرفي شدهاند سلولهاي بنيادي القايي (ipscs) هستند. اين سلولها با باز برنامهريازي 18

19 سلولهاي سوماتيک مانند فيبروبالستها توليد ميشوند و خاواص تکثياري و تماايزي باااليي مانناد سلولهاي بنيادي جنيني دارند ]4[. با توجه به اينکه اين سلولها را براي هر فردي ميتوان سااخت امکان کاربرد آنها و مشتقات سلولي آنها به صورت اتولوگ فراهم اسات. يک يا از محادوديت هااي مطرح شده در زمينه استفاده ازسلوله يا ips احتمال تومورزايي آنها ميباشد. به منظور رفاع اي نا محدوديتها ميتوان در پديده اي که دگر تمايزي ناميده ميشود ياک ناوع سالول ساوماتيک را باه سلول هدف مورد نظر تبديل کرد. تبديل مستقيم يک سلول سوماتيک بالغ به سلول بالغ يا پيش ساز سلول ديگر بدون آنکه به حالت پرتوان تبديل شود امروزه تحت عناوان Trans-differentiation ناميده ميشود. Trans-differentiationمطلوب اغلب با استفاده از فاکتور هاي نساخه بارداري خااص ي کا سلول و يا بافت خاص در محيط مناسب صورت ميگيرد. اين فرآيند با کمک و بر پايه واساطه هاا و فاکتورهاي کليدي درگير در تکوين نوع خاصي از سالول و ياا فاکتورهااي نساخه بارداري درگيار در تعيين سرنوشت سلول جنيني صورت ميگيرد. بهترين کانديدا فاکتورهايي هستند که که حذف آنها سبب نقصان تکويني شديد و يا عدم تشکيل يک نوع خاص سلول مي گردد. بنابر اين به منظور تمايز به نوع خاصي از سلول فاکتور کليدي موثر در تکوين آن و يا بيان گذراي فاکتورهاي موثر در پرتواني و استفاده از محيط تعيين کننده سرنوشت مطلوب مورد نياز ميباشد. اولين بار Bhatia و همکااران نشان داند که از فاکتورهاي پرتواني ميتوان در Trans-differentiation استفاده نمود] 5 [ در اين راستا ميتوان به تبديل موفقيت آميز سلول هاي فيبروبالست به سلول هاي عضله قلبي غضروف و... اشاره کرد. پيش بيني شده است که کارايي سلول هاي القا شده باا Trans- differentiation باه فاصله اپيژنتيکي بين سلوله يا مبدا و مقصد و قدرت تنظيم يا فااکتور هااي نساخه بارداري ماورد استفاده بستگي دارد. همچنين مشاهدات نشان داده است که کاارايي Trans- Differentiation 13

20 بيشتر از باز برنامهريزي به وضعيت pluripotent ميباشد چرا که در اين فرايند سلولهاا تغييارات ا يپ ژنتيکي کمتري متحمل ميشاوند. باه منظاور Trans-Differentiation از روشهاايي چاون اعمال عصاره سلولي که حاوي اجزاي سلولي مورد نظر است به سلول مبدا بيان رسپتورهاي ويژه باه منظور حساس کردن سلوله يا مبدا به مسيره ي سيا گنالينگ خاص و يا استفاده از فاکتورهاي نسخه برداري خاص و ويژه سلول هدف استفاده شده است] 1 [ مورد در تبديل مستقيم به سلول هاي عصبي گزارشهاي متعددي در سال ارايه و گرديد. تبديل سلوله يا آستروسيت انساني به سلوله يا بنيادي عصبي )NSC( 1 با استفاده از بيان مجزاي سه فاکتور Sox2 و از جمله گزارش هاي ارايه شده در راستاي Trans- differentiation مي Nanog Oct4 باشد] 4 [. گزارشهاي متعددي مبني بر استفاده از منابع سلولي آستروسيتي براي تبديل به نورون با فاکتورهاي مختلف نسخه برداري ارايه شده است. در دو تحقيق از لنتي ويروس حامل فاکتور نسخه برداري به منظور تبديل سلوله يا آستروسيت را به سلوله يا نوروبالست در مغز و نخاع استفاده Sox2 شد ]8, 3[. توان تبديل سلوله يا آستروسيتها به نورون در تحقيق ديگري با استفاده از فاکتور هاي رشد و در ناحيه استرياتوم نشان داده شد ]11[. همچنين آستروسيت ها با استفاده از فاکتورهاي Neurog2 نسخه برداري مثل و يا يا Ascl1 ظرفيت بااليي براي تبديل به نورون از خود نشان Dlx2 NeuroG2 دادند] [ ويا Addis و همکاران تبديل آستروسيتها به عنوان سلول اوليه در فرآيند دگر تمايزي براي توليد نورون هاي دوپامينرژيک با افزايش بيان سه ژن Mash1, lmx1b, Nurr1 گزارش کردهاند] 14 [. در ايران نيز گزارش دهقان و همکاران نشان داد فاکتور نسخه برداري Oct4 در کاربرد درون بطن مغزي قادر است جمعيت پيش سازها و توان ترميم مغز را افزايش دهد. در مطالعه ديگري و کاسمان قاسمي همکاران نشان دادند که با استفاده از کالستر مي توان به طور موفقيت آميزي سلول Micro RNA Neural Stem Cells 21

21 ه يا آستروسيت ناحيه استرياتوم موش و سلولهاي آستروسيت انساني را به نوروبالست تبديل کرد. اين نوروبالستها توان تبديل به نورون بالغ گلوتاماترژيک و ايجاد پتانسيل عمل را داشتند ]15[. باز برنامه ريزي آستروسيت هاي بالغ با استفاده از فاکتورهاي رونويسي نوروژنيک فرآيندي با کارآيي ips بسيار باالست و نشان داده شده که ips به دست آمده از آستروسيت ها در مقايسه با مشتق از ips فيبروبالست هاي جنيني موش پتانسيل بيشتري تمايز عصبي براي دارند. اين نشان مي با دهد که منشا آستروسيت حافظهاي از اپي ژنتيک CNS اوليه را به همراه دارد] 11 [. اخيرا نشان داده شده است که in vivo آستروسيت ها مي توانند منبع مناسب توليد نورون به صورت باشند] 14 [. اخيرا در دو مطالعه از سلول فيبروبالست جنيني موش به عنوان سلول اوليه براي تبديل مستقيم به سلول هاي پيش ساز اليگودندروسيت استفاده شده است. در اين دو تحقيق غربالگري فاکتور هاي رونويسي انتخاب شده از آناليزهاي پروفايل ژني انجام شده و با رويکردdown top در يکي از دو گروه تحقيقاتي به ترکيب ژني شامل فاکتورهاي Olig2, Sox10, Zfp536 و در گروه ديگر به Olig2, Sox10, Nkx6.2 رسيده اند. به علت حضور دو فاکتور در هر دو ترکيب ژني به نظر مي رسد اين دو فاکتور اثر القايي اصلي تري در OLIG2, SOX10 اين فرآيند داشته باشند] 18, 13[. 2- سلول درماني در بيماريه يا نورودژنراتيو هر نوع سلول بنيادي داراي تواناييها مزايا و معايب خاص خود است و تصميم به استفاده از هر کدام از آنها به هدف از کاربرد سلول و نتايج مورد انتظار بستگي دارد. نکته ديگري که همواره بايد مورد توجه قرار گيرد ارتباط عملکرد سلول با مکانيزم بيماري است. انتخاب سلول مناسب و مکانيزم عمل مورد انتظار از سلول تنها اولين مرحله در سلول درماني است. فرآيند انتقال دانش از آزمايشگاه تحقيقاتي به بالين بيمار پيچيده و براي هر بيماري متفاوت است. قبل از طراحي کارآزمايي و در حين اجراي آن 21

22 موضوعات و نکات مختلفي ظهور و بروز خواهد داشت که بايد در حين اجرا و يا در تفسير نتايج مد نظر قرار گيرد. استفاده از بيماران درگير با مراحل آخر بيماري از يک طرف احتمال به خطر افتادن کيفيت زندگي بيماران در اثر سلول درماني را کاهش ميدهد و از سوي ديگر به دليل آسيبهاي زياد وارد آمده به بدن احتمال مشاهده اثرات مثبت براي درمان را کم ميکند. سلول درماني توسط سلولهاي بنيادي مزانشيمي با توجه به اثرات ضد التهاب و سايتوکاينها و فاکتورهاي مترشه بيشتر با هدف کند کردن و يا توقف روند بيماري صورت مي گيرد. اين نوع سلول درماني در اغلب بيماريه يا تحليل برنده سيستم عصبي قابل استفادهاند مگر شرايطي که بيماري پيشرفت زيادي داشته و در حال حاضر سير بدتر شدن آن متوقف شده است. به عنوان مثال در يک بيمار با ضايعه تروماتيک مغزي يا نخاعي که مدت زيادي از بروز ضايعه گذشته و آسيب مستقر شده است نمي توان زياد به اين نوع از سلول درماني دلخوش بود. در مقابل بيماريهايي مانند ام.اس و اي.ال.اس کامال متاثر از روندهاي التهابي هستند و اين نوع سلول درماني تواند کارآيي مي خوبي در توقف روند بيماري داشته باشد. نوع ديگر سلول درماني با هدف جايگزيني سلولهاي از دست رفته صورت مي گيرد. در خصوص بافت عصبي سلول از دست رفته غالبا نورونها و اليگودندروسيتها مي اين باشند. از ديدگاه نوع سلول از دست رفته و محل آن بيماريها مي توانند ساده و يا پيچيده باشند. مثال در بيماري پارکينسون نوع سلول از دست رفته سلولهاي دوپامينرژيک و محل آن محدود به جسم سياه است. لذا در اين بيماري سلول درماني با هدف جايگزيني سلولها در دسترستر به نظر مي رسد. در بيماري ام.اس تا قبل از مرحله ناتوان کننده دوران پايا ين بيماري سلولهاي از دست رفته اليگودندروسيتها هستند اما بيماري منتشر بوده و از بيماري تا بيمار ديگري متفاوت است لذا سلول درماني با هدف جايگزيني سلول در اين بيماري را راه درازتري نسبت به بيماري پارکينسون پيش رو دارد. در برخي بيماريها مانند ضايعات نخاعي شرايط بسيار پيچيده 22

23 است. در اثر ضربه انواع مختلف سلولها از جمله نورونهاي مختلف مهاري و تحريکي و اينترنورونها و خروجيه يا نورونها و موتور نورونها در کنار اليگودندروسيتها و آستروسيتها از بين ميروند. بعالوه راههاي عصبي باالرو و پايين رو )آکسونها( نيز از بين رفته اند. لذا شرايط بيماري بسيار پيچيده بوده و عمال راه درازي تا سلول درماني موفق اين نوع ضايعات در پيش است. آسيب هاي تروماتيک مغز و آسيبهاي ناشي از سکته هاي مغزي نيز تا حد زيادي از شرايط مشابه برخوردار است. نکته قابل تامل ديگر ماهيت وراثتي يا غير وراثتي است. وقتي بيماري نقص ژنتيکي از علل بيماري باشد سلول درماني با هدف جايگزيني سلول را با يک مرحله پيچيده اضافي همراه مي سازد. سلول درماني با سلولهاي مشتق ار خود فرد قبل از هر چيز نيازمند تصحيح ژنتيکي است بيماري پارکينسون 15 بيماري پارکينسون يک بيماري نورودژنراتيو با بروز 2 درصد در افراد باالي سال است که با از دست رفتن فزاينده نورونهاي دوپامنيرژيک در بخشي از ماده سياه مغز (Sabstantia nigra pars بروز مينمايد و منجر به کاهش دوپامين در استرياتوم ميشود. از عوارض شناختي اين compacta) بيماري ميتوان به اختالل در يافتن مسير مشکل در برنامه ريزي و اجراي کارهاي چند مرحلهاي و مشکل در توجه و امور وابسته به آن مانند گفتگو در جمع چند نفره اشاره کرد. عالئم باليني اين بيماري با لرزشهاي ضعيف در اندام شروع شده و به سفتي اندامها و بدن و مشکل در شروع حرکت ميانجامد. نقش دوپامين آزاد شده توسط اين سلولها دراسترياتوم تنظيم نورونهايي است که کنترل حرکت را به عهده دارند. درمان اوليه اين بيماري داروي ال-دوپا( L-DOPA ) است که مغز آن را به دوپامين تبديل مي نمايد. پاسخ اوليه به اين دارو خوب است اما به مرور زمان اثرات دارو کاهش و عوارض جانبي آن افزايش مييابد. به اين دليل امروزه تالش زيادي براي يافتن درمانهاي جايگزين شامل فاکتورهاي رشد براي نگهداري نورونهاي دوپامينرژيک و پيوند سلولي براي جايگزيني سلولهاي از دست رفته در جريان است. 23

24 يکي از اولين تالشها در سالهاي 1385 تا 1384 توسط surgeons انجام شد. او تالش نمود تا سلول- هاي دوپامينرژيک بدست آمده از غده آدرنال مريض را به خود او پيوند نمايد. نتيجه تنها بهبود نسبي و گذراي بيمار بود ]21, 21[. بر پايه مطالعات انجام شده روي موشهاي صحرايي و ميمونهاي مدل شده براي بيماري پارکينسون در محدودهي سال 2111 دو مطالعه انساني ديگر در آمريکا با استفاده از پيوند بافت عصبي جنينهاي سقط شده به بيماران انجام شد ]22, 23[. در هر دو مطالعه برخي بيماران بهبود نسبي را نشان دادند اما بقيه دچار عوارضي مانند ديسکنزي و حرکات پرشي غير ارادي شدند که همان عوارض جانبي استفاده طوالني مدت از ال-دوپا مي باشند. برخي از شواهد مبني بر تهاجم سيستم عصبي به سلول هاي پيوند شده نيز گزارش گرديد. نکته ديگر اينکه در مجموع پاسخ بيماران جوانتر و ميانسال به پيوند بهتر بود. با پيشرفت دانش سلولهاي بنيادي استفاده از اين سلولها در دستور کار محققان قرار گرفت. يک سلول درماني قابل قبول در بيماري پارکينسون بايد پايدار باشد باعث بهبود بارزي در حرکت شود عوارض مداخله کننده در فعاليت بيمار را برطرف نمايد و يا با پيشرفت بيماري مقابله نمايد. پيوند نورونهاي دوپامينرژيک مشتق از سلولهاي بنيادي جنيني و يا سلولهاي بنيادي مزانشيمي در مدل حيواني بيماري پارکينسون بهبود عملکرد را به دنبال داشته است. تکنولوژي سلولهاي بنيادي القايي توليد سلولهاي پرتوان ويژه مريض و تبديل آنها به نورونهاي دويامينرژيک را امکان پذير کرده است. پيوند اين سلولهاي دوپامينرژيک به مدل پارکينسون در جوندگان بهبود نقايص حرکتي و جايگزيني سلولها در بافت را نشان داده است ]24[. استفاده از سلولهاي بنيادي براي غنيسازي محيط عصبي و حفاظت نورونهاي دوپامينرژيک براي کاهش يا توقف تخريب آنها نيز مد نظر بوده است. همچنين از سلولهاي بنيادي براي مدلسازي بيماري پارکينسون استفاده شده است و از سلولهاي پوست بيماران پارکينسوني )نوع ژنتيکي بيماري( سلولهاي پرتوان القايي ساخته شده است و در محيط آزمايشگاه مورد بررسي قرار گرفته است. در يکي از اين 24

25 مطالعات از موشهاي پارکينسوني با استفاده از تکنيک انتقال هسته سلولهاي بنيادي پرتوان ساخته شد و پس از تمايز به سلولهاي دوپامينرژيک تمايز داده شده و به صورت اتولوگ و همچنين آلوگرافت به موشهاي پارکينسوني پيوند شده است. موش هاي پيوند شده به صورت اتولوگ در تمام تست ها بهبودي را نشان دادند و در يکي از اين موشها رشد بيش از حد سلولها ديده شد که بيش از سلول TH مثبت و سلول هاي منفي براي بيان TH بودند اما سلولهاي غير نوروني و بنيادي نداشتند. در پيوند هاي آلوگرافت زنده ماني سلولها کم بوده و در سه موش سلولي ديده نشده و متوسط سلول هاي زنده 111 سلول بوده است. در پيوند سلولهاي عصبي حاصل از سلولهاي مزانشيمي که در ميمون انجام شده از 5 ميمون سلولهاي مزانشيمي استخراج شده و پس از کشت با استفاده از يک روش خاص به سلولهاي دوپامينرژيک القا شدهاند. سپس اين سلولها به ميزان 14 ميليون در جسم مخطط پيوند شدند و ارزيابي- ها با استفاده از PET و ايمونوهيستوشيمي و تعداد چرخشها انجام شد. نتايج اين مطالعه نشان داد که پيوند اتولوگ سلول هاي دوپامينرژيک حاصل از مزانشيم در مدل ميموني عالوه بر اينکه ايمن بوده و تکثير و توموري مشاهده نشده ميتواند سبب بهبود در رفتار شود. يافتههاي آزمايشگاهي در حيوانات مدل تنوع سلولهاي بنيادي قابل استفاده امکان استفاده ترکيبي از راهبردهاي درماني و دست آخر سادگي پاتوبيولوژي بيماري از نظر يکدست بودن سلولهاي از دست - رفته و تمرکز محل آسيب ورود سلول درماني اين بيماري به مرحله کارآزماييهاي باليني و اميدها براي درمان آن را افزايش داده است. در حال حاضر محققان سوئدي در دانشگاه لوند يک کمپاني را براي سلول بيماري براي درماني پارکينسون با استفاده از سلول هاي مختلف راه اندازي کرده اند که در مراحل مقدماتي کار است و اميد مي رود که به زودي آغاز به کار کند. جدول شماره خالصه اي از مطالعات انجام شده براي سلول درماني بيماري پارکينسون را نشان مي دهد. 25

26 جدول شماره 4: مطالعات مربوط به کاربرد سلولهاي بنيادي در بيماري عنوان پارکينسون نتايج روش مطالعه مجله و سال Journal of, neurosurgery 1985; vol. 62, no 2: [25] بافت غده فوق کليوي به دو بيمار مبتال به پارکينسون شديد به صورت اتولوگ در جسم مخطط پيوند شد. برخي از اثرات مثبت پيوند مشاهده شد Transplantation of adrenal medullary tissue to striatum in parkinsonism N engl j med 1987; 316: 831 4[26] بافت غده فوق کليوي به بيماران مبتال به پارکينسون به صورت اتولوگ در جسم مخطط پيوند شد بهبود وضعيت در هر دو بيمار 15 و 1 روز پس از پيوند مشاهده شد. سفتي و کنترل حرکات در يکي از بيماران 11 ماه پس از پيوند بهتر شد و لرزش ها کاهش يافت. Open microsurgical autograft of adrenal medulla to the right caudate nucleus in two patients with intractable parkinson's disease Neuroscience letters volume 71,, 21 issue 3 november 1986, pages [27] بافت جسم سياه از جنين هاي انساني سقط شده در سه ماه اول بارداري به جسم مخطط رت هاي مدل پارکينسون پيوند شد. رت ها با سيکلوسپورين تيمار شدند. چرخش به واسطه تزريق آپومورفين در حيوانات پيوند شده 41 تا 81 درصد سه ماه پس از پيوند کاهش يافت. Human fetal substantia nigra grafted to the dopamine-denervated striatum of immunosuppressed rats سلول هاي پرتوان پيوند به مغز يا کپسول کليه سبب القاي Exp neurol jan; 149(1):28-41[28]. بالستوسيست موشي که در حضور LIF رشد کرده اند را به مغز سالم مغزهاي مدل پارکينسون و کپسول کليه موش ها پيوند زدند. تمايز اين سلولهاي پرتوان به سلولهاي دوپامينرژيک و سروتونرژيک مي شود و در جسم مخطط موش مدل اين سلولها با نورون هاي ميزبان ارتباط سيناپسي برقرار مي کنند. Blastula-stage stem cells can differentiate into dopaminergic and serotonergic neurons after transplantation سلولهاي بنيادي جنيني حقيقي زماني که Bjo rklund et al., 2002 pnas vol. 99,no 4: [29] پيوند سوسپانسيون سلول هاي بنيادي جنيني با تعداد سلول کم در جسم مخطط رت هاي مدل بيماري پارکينسون با دانسيته پايين پيوند مي شوند به نورون ه يا شبيه نورون هاي دوپامينرژيک تمايز مي دهند و سبب کاهش چرخش حيوان شده و بيان پروتئين هاي پيش سيناپسي را بهبود مي دهند. Embryonic stem cells develop into functional Dopaminergic neurons after transplantation In a parkinson rat model Nature, vol 418, 4 july 2002[30] جمعيت سلولي غ ين سازهاي مغز ميا ين بيان از پيش را با افزايش نورون ه يا دوپامينرژيک توليد شده با اين روش از لحاظ الکتروفيزيولوژي و nurr1 در سلولهاي خصوصيات سلولي شبيه نورون هاي مغز Dopamine neurons derived from Embryonic stem cells function in an 21

27 Takagi et al., j. Clin. Invest. 115: (2005)[31] Cho 2008,pnas vol. 105, no 9: [32] Roy, 2006, nat med12: [33] بنيادي جنيني موشي به دست آورده و در مدل حيو يان پارکينسون پيوند زده اند. ميا ين هستند و پس از پيوند تا 8 هفته تومورزايي نداشته اند. پيش سازهاي عصبي پس از تيمار با FGF20 در صد بااليي از نورون هاي سلولهاي پيش ساز عصبي حاصل از سلول هاي بنيادي جنيني ميمون پس از القاي توسط سلول هاي استرومايي و در محيط داراي فاکتورهاي رشد فيبروبالستي 2 و 21 به جمعيت بااليي از نورون هاي دوپامينرژيک تمايز يافتند. دوپامينرژيک را مي سازند و در طي پيوند به ميمون قادر هستند که سبب بهبود عالئم بيماري شوند. تمايز سلولهاي بنيادي جنيني سلولهاي hesc با اين پروتکل تا 81 انساني به نورون هاي بيان درصد کل نورون ها به نورون هاي دوپامينرژيک تمايز يافتند. و پس از پيوند بهبود رفتار واضحي را در رت هاي مدل پارکينسون ايجاد کردند. نورون هاي حاصل از اين روش قادر هستند که پس از پيوند به مدل حيواني پارکينسون سبب بهبود عملکرد را به ميزان زيادي شوند. کننده TH به صورت تجمعات نوروني spherical neural masses (snm) هم کشتي سلولهاي hesc با آستروسيت هاي مغز ميا ين ميرا و با اضافه کردن فاکتورهاي Shh و FGF8 نا Animal model of parkinson s disease Dopaminergic neurons generated From monkey embryonic stem cells function In a parkinson primate model Highly efficient and largescale generation Of functional dopamine neurons from Human embryonic stem cells Functional engraftment of human es cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes Yasuhara et al., j. Neurosci., 2006, 26(48): [34] Hedlund et al. Stem cells june ; 26(6): [35] Yang et al., stemcells, 2008;26:55 پيوند سلولهاي بنيادي عصبي انساني سلول هاي الين hb1.f3 که با GFP نشاندار شده اند پس از پيوند به جسم مخطط رت هاي پارکينسوني سبب حفاظت نوروني شده و نشانه هاي رفتاري بيماري را در مقايسه با گروه کنترل بهبود دادند. hb1.f3 که با وارد کردن ژن v-myc ناميرا شده اند به رت هاي مدل بيماري پارکينسون سلولهاي تراريخته بنيادي موشي که در آنها ژن گزارشگر سلول هاي جداسازي شده قابليت تقسيم شدن ندارند و 2 تا 5 درصد سلولهاي زنده کشت را تشکيل مي دهند و پس از جداسازي تا 31 درصد خالص شدند. پيوند اين پيش سازها سبب کم شدن تعداد چرخش هاي حاصل از آمفتامين و آپومورفين شد. تحت پروموتر PITX3 GFP است پس از تمايز و جداسازي با فلوسيتومتري به رت هاي مدل پارکينسون پيوند شدند. نورون هاي دوپامينرژيک تمايز اغلب سلول هاي پيش ساز به نورون هاي دوپامينرژيک تمايز يافته بودند و فنوتيپ Transplantation of human neural stem cells exerts Neuroprotection in a rat model of parkinson s disease Embryonic stem cellderived pitx3-enhanced green fluorescent Protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by Fluorescence-activated cell sorting and function in an animal Model of parkinson s disease Human embryonic stem cell-derived dopaminergic neurons 24

28 يافته در محيط آزمايشگاه به جسم مخطط رت هاي مدل پارکينسون پيوند شد و زنده ماني سلول ها تمايز و تکثير آنها و بهبود رفتار حيوان 4 1 و 21 هفته بعد بررسي شد. مغز ميا ين را دارا بودند. به عالوه سلو هاي [36]63 پيوند شده قدرت تقسيم خود را پس از 5 ماه از دست مي دهند و نورون ها و گليا تمايز مي دهند. سلول ها به خوبي تکثير شده و به نورون ه يا دوپامينرژيک تمايز مي يابند و منبع خوبي براي سلول درماني پارکينسون هستند. Parish et al., j. Clin. Invest. 118: (2008)[37] توليد باالي نورون هاي دوپامينرژيک بر اساس تکثير و تمايز سلولهاي بنيادي و پيش ساز مغز ميا ين در حضور فاکتورهاي FGF 2, 8 و SHH که ژن WNT5a در آنها به مقدار زياد بيان مي شود. Reverse functional deficit in parkinsonian rats Wnt5a-treated midbrain neural stem cells Improve dopamine cell replacement therapy In parkinsonian mice Ko et al., molecular therapy vol. 17 no. 10, oct. 2009[38] هيچگونه تراتوما يا توموري در رت هايي که پيوند از پاساژهاي مختلف اين پيش سازها را گرفته بودند مشاهده نشد. بيان bcl-xl و SHH در سلولهاي پيش ساز سلول هاي hesc به صورت هوموژن به پيش سازهايي تمايز يافتند که پس از تمايز نهايي غ ين از نورون هاي دوپامينرژيک بودند. تراريخت مي تواند مشکالت مربوط به زنده ماني سلول ها پس از پيوند را برطرف کند. Conditions for tumor-free and dopamine Neuron enriched grafts after transplanting Human es cell derived neural precursor cells بيان زياد lmx1a سبب پيشبرد تمايز Friling et al., pnas 2009, vol. 106, no. 18: [39] بيان نابجاي lmx1a تحت توالي تنطيمي ژن nestin در سلول هاي بنيادي جنيني موشي و انساني و تمايز آنها به سلول هاي دوپامينرژيک و پيوند در رت هاي جوان سلولهاي بنيادي جنيني به نورون هاي دوپامينرژيک مي شود. پيوند پيش سازهاي به دست آمده با اين روش به رت هاي جوان نشان داد که اين سلول ها زنده مانده و از لحاظ مورفولوژي و بيان ژني بسيار شبيه به نورون هاي مغز اين رت ها هستند. Efficient production of mesencephalic dopamine Neurons by lmx1a expression in embryonic stem cells Soldner et al., 2009, cell 136, [40] فيبروبالست هاي حاصل از 5 مريض داراي پارکينسون با کارايي باال به سلولهاي بنيادي القايي بازبرنامه ريزي شدند و اين سلول ها در محيط آزمايشگاه به نورون هاي دوپامينرژيک تمايز يافتند. فاکتورهاي مداخله گر براي بازبرنامه ريزي سلولهاي بنيادي القايي حاصل از اين بيماران از اين سلولها خارج شد و اين سلول ها پس از خارج شدن ژنهاي تراريخت حالتي مشابه سلولهاي بنيادي جنيني داشتند. Parkinson s disease patient-derived Induced pluripotent stem cells Free of viral reprogramming factors Hargus et al., pnas, 2010 vol. الين هاي سلولهاي پرتوان الين هاي سلولهاي پرتوان القايي حاصل از Differentiated parkinson patient-derived induced 28

29 107, no. 36: [41] القايي که از بيماران پارکينسوني به دست آمده اند توانايي تمايز به نورون هاي دوپامينرژيک را دارند و در مدل حيو يان پارکينسون پيوند و يل بيماران پس از تمايز به نورون هاي دوپامينرژيک به ميزان زيادي زنده ماندند نرمال نبودند. خالص سازي اين سلولها با استفاده از NCAM قبل از پيوند نشان داد که پس از پيوند اين سلول ها به ميران Pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain And reduce motor asymmetry in parkinsonian rats شدند. بلالتري در مغز زنده مانده و تعداد چرخش ه ي حيا وان کاهش مي يابد. Stem cells mar 31;28(3):501-12[42] بيان foxa2 در پيش سازها سبب متوقف شدن سيکل سلول و تمايز آنها مي شود و ه يا در نتيجه سبب بهبود بلوغ و عملکرد نورون حاصل مي شود. بيان همزمان nurr1 و foxa2 سبب بهبود تمايز به نورونهاي ناحيه A9 مي شود که عملکرد و زنده ماني باالتر و تومورزايي کمتري پس از پيوند دارند. سلولهاي پيش ساز عصبي از مغز موش و رت و سلولهاي انساني حاصل از hesc با استفاده از وکتورهاي رترويروسي براي ژن هاي SHP dax1 nurr1 foxa1 ERR RXRa و foxa2 تراريخت شدند و سپس در مدل حيو يان Foxa2 and nurr1 synergistically yield a9 nigral dopamine neurons Exhibiting improved differentiation, function and cell survival پارکينسون پيوند شدند. Sanchez et al., brain(2008),13 1, [43] پيوند اين نورون ها سبب بهبود رفتار در مدل بيماري مي شود و تيمار اين سلولها در مراحل پايا ين تمايز در آزمايشگاه با wnt5a و FGF 2, 20 سبب زنده ماني با استفاده از ساختن الين هاي پرتوان سلولي از يک والد )پارتنوژنسيس( در ميمون اين سلول ها به نورون هاي دوپامينرژيک تمايز يافته و به مدا پارکينسون پيوند شدند. بيشتر بعد از پيوند و تسريع روند بهبودي شود. Parthenogenetic dopamine neurons from primate embryonic stem cells restore function in experimental parkinson s disease از موش هاي پارکينسوني با Tabar et al., nat med april ; 14(4): [44] موش هاي پيوند شده به صورت اتولوگ در تمام تست ها بهبودي را نشان دادند و در يکي از اين موشها رشد بيش از حد سلول ها ديده شد که بيش از سلول TH مثبت و سلول هاي منفي براي بيان TH بودند اما سلول هاي غير نوروني و استفاده از تکنيک انتقال هسته سلول هاي بنيادي پرتوان ساخته شد و پس از تمايز به سلولهاي دوپامينرژيک تمايز داده شده و به صورت اتولوگ و همچنين آلوگرافت به موشهاي پارکينسوني پيوند شده است. برا ردديا يب نورون هاي اتوگرافت از سيستم cre-lox و ژن گزارشگر GFP استفاده شده است. بنيادي نداشتند. در پيوند هاي آلوگرافت زنده ماني سلول ها کم بوده و در سه موش سلولي ديده نشده و متوسط سلول هاي زنده 111 سلول بوده است. Therapeutic cloning in individual parkinsonian mice Kriks et al., nature, vol 000, 2011[45] معرفي پروتکل جديد مبتني بر القاي سلولهاي کف مغز از سلول هاي پرتوان انساني با سلول هاي مغز ميا ين شکمي شده از سلول ه يا پرتوان انساني 11 روز پس از تيمار با کوچک مولکول هاي مسيرهاي shh و Dopamine neurons derived from human es cells Efficiently engraft in animal models of 23

30 استفاده از محرک هاي مسير wnt حاصل شدند و خصوصيات آنها شبيه Parkinson s disease SHH و WNT و پيوند به سلول هاي دوپامينرژيک جنيني بود. سلول هاي حاصل در مدل پيوند اين سلول ها و ارزيا يب در مدت ه يا پارکينسون موش رت و طوالني نشان داد که اين سلول ها با سلول ميمون ه يا ميزبان سيناپس داده اند و به نورون ه يا دوپامينرژيک تبديل شده اند. نورون هاي دوپامينرژيک حاصل از سلول الين هاي متعدد سلو هاي ه يا پرتوان القايي به روش لنتي ويروس پرتوان القايي که با استفاده از ميزان بيان کمي از ژن هاي خارجي را Rhee et al., j clin invest.2011;121 (6): [46] نشان دادند اما در روش رترو و پروتئين اين بيان مشاده نشد. سلول هاي بنيادي عصبي حاصل از روش هاي ويروسي در طي پاساژ سلولي دچار پيري و آپوپتوز شدند که در اثر بيان p53 بود. پيوند سلول هاي حاصل روش هاي مختلف همانند لنتي ويروس ها رترو ويروس ها و با استفاده از پروتئين توليد شده اند به نورون هاي دوپامينرژيک تمايز يافته و در Protein-based human ips cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of parkinson disease مدل پارکينسون مقايسه شدند. از روش پروتئيني سبب بهبود رفتار در حيوان مدل پارکينسون شد. توليد سلول هاي پرتوان القايي از سلول پوست بيمار Nguyen et al., Cell Stem Cell 8, , 2011[47] پارکينسوني که در ژن LRRK2 داراي موتاسيون p.g2019s است. اين سلول ها تمايز يافته و از نظر خصوصيات ريخ يت و بيان ژني با نورون هاي حاصل از سلول نورون هاي حاصل از سلول هاي پرتوان القايي داراي موتاسيون مستعد تغيير در اثر استرس اکسيداتيو نقص در سيستم ميتوکندري يا نقص در تجزيه پروتئين هستند. LRRK2 Mutant ipsc- Derived DA Neurons Demonstrate Increased Susceptibility to Oxidative Stress ه يا بنيادي جنيني نرمال مقايسه شدند. Daadi et al., Plos one ; July 2012, Vol 7, Issue 7 : e41120[48] سلول هاي بنيادي عصبي حاصل از hesc پس از قرار گرفتن در معرض فاکتورهاي ترشح شده از سلول هاي گليا و bfgf و LIF مي توانند سبب تمايز به القاي سلول هاي دوپامينرژيک از سل.ل هاي hesc و پيوند آنها در مدل ميمون پارکينسون نورون هاي دوپامينرژيک شوند و اين نورون ها پس از پيوند به مدل پارکينسون ميموني سبب بهبود رفتار مي شوند. Dopaminergic Neurons from Midbrain-Specified Human Embryonic Stem Cell- Derived Neural Stem Cells Engrafted in a Monkey Model of Parkinson s Disease Kirkeby et al., Cell Reports 1: 1 12, June 28, 2012[49] با استفاده از پروتکل معرفي شده با کارايي باال سلول هاي پيش ساز مغز ميا ين به دست مي آيند که پس از تمايز قادرند نورون هاي بالغ و با عملکرد قابل مقايسه نسبت به نورون هاي جنين را به وجود معرفي يک پروتکل با کارايي باال براي تمايز نورون هاي دوپامينرژيک از سلول هاي hesc با استفاده از مهار SMAD ها و تشکيل اجسام Generation of Regionally Specified Neural Progenitors and Functional Neurons from Human Embryonic Stem Cells under Defined Conditions 31

31 شبه جنيني بياورند که پس از پيوند قادر هستند زنده مانده و سناپس داده و سبب بهبود در تعداد چرخش هاي حيوان شوند. Ganat et al., J Clin Invest. 2012;122(8): [50] جداسازي کردن سلول ها پس از تمايز بر اساس ژن hes5 نشان داد که اين پيش سازها قدرت تکثير دارند و پس از تمايز تعداد کمتري نورون دوپامينرژيک مي سازند اما پيش سازهاي حاصل از pitx3 و nurr1 قدرت تکثير ندارند و درصد بيشتري نورون دوپامينرژيک مي سازند. مقايسه بيان ژن با ريزآرايه در اين سه جمعيت سبب معرفي ژن هاي مربوط به پروتئين هاي سطحي CHRNA6 و CHRNB3 در موش و انسان شد. با استفاده از سيستم کروموزوم مصنوعي باکتري سه الين تراريخت براي ژن هاي Hes5 Nurr1 و pitx3 از سلول ه يا بنيادي جنيني موش توليد شده که ژن GFP تحت پروموتر اين ژن ها قرار دارد و در مراحل مختلف تمايزي اين سلول ها بر اساس بيان هر کدام از اين ژنها جداسازي شده و با هم مقايسه شده اند. Identification of embryonic stem cell derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment نورون هاي داراي موتاسيون و نورون هاي اصالح شده پس از 8 هفته تمايز از لحاظ Chung et al,. Science 22 November 2013: Vol. 342 no pp [51] از بيماران پارکينسون داراي موتاسيون در ژن a-syn سلول ه يا پرتوان القايي ساخته شد و به نورون هاي کورتيکال تمايز يافت و با نورون هاي نرمال مقايسه شد. الکتروفيزيولوژي فعال بودند و جريانات کلسيمي مشابه داشتند. در غربالگري با استفاده از مخمر نورون هاي داراي موتاسيون به استرس نيتروزاتيو و شبکه اندوپالسمي و تخريب پروتئيني حساس بودند و در غربالگري براي کوچک مولکول Identification and Rescue of a-synuclein Toxicity in Parkinson Patient Derived Neurons ها NAB2 و nedd4 توانستند از نورون ها در مقابل اين استرس ها محافظت کنند. از 5 ميمون سلول هاي مزانشيمي استخراج شده و پس Hayashi et al., J Clin Invest.2013;12 3(1): [52] از کشت با استفاده از يک روش خاص به سلول هاي دوپامينرژيک القا شده اند. سپس اين سلول ها به ميزان 14 ميليون در جسم مخطط پيوند شدند و ارزيا يب ها با پيوند اتولوگ سلول هاي دوپامينرژيک حاصل از مزانشيم در مدل ميموني عالوه بر اينکه ايمن بوده و تکثير و توموري مشاهده نشده مي تواند سبب بهبود در رفتار شود. Autologous mesenchymal stem cell derived dopaminergic neurons function in parkinsonian macaques استفاده از PET و ايمونوهيستوشيمي و تعداد چرخش ها انجام شد. Sundberg et al., STEM CELLS 2013;31: [53] در اين مطالعه نشان داده شده که پيش سازهايي که بيان باال و CD29 NCAM سلول هاي پرتوان القايي حاصل از ميمون و انسان با چهار روش مختلف به سلول پايين دارند از نظر بيان ساير ژن هاي Improved Cell Therapy Protocols for Parkinson s Disease Based on Differentiation 31

32 ه يا دوپامينرژيک تمايز يافته و پس از 31 روز بر اساس بيان نورون هاي دوپامينرژيک غني تر هستنند و پيوند اين سلول ها به مدل ميمون سبب بهبود حرکات ارادي مي شود و سلول هاي اتولوگ تا يک سال بعد بدون سرکوب سيستم ايم ين قابل رديا يب هستند و سلول NCAM و CD29 جداسازي شده و در مدل رت و ميمون به صورت اتولوگ پارکينسون Efficiency and Safety of hesc-, hipsc-, and Non-Human Primate ipsc- Derived Dopaminergic Neurons پيوند شدند. ها در مدل موشي به سلول هاي ميزبان سيناپس مي دهند. سلول هاي بنيادي جنيني پيوند سلول ها در مرحله EB به ميزان Cell Transplantation, Vol. 22, pp , 2013[54] موشي در طي مراحل تمايز مختلف اجسام شبه جنيني پيش ساز عصبي و سلول هاي بالغ عصبي در مدل ژنتيکي موش آفاکيا Aphakia پيوند 2111 سلول سبب تشکيل تراتوما مي شود و پيوند سلول هاي بالغ به ميزان سلول زنده ماني کمي دارد اما پيوند در مرحله پيش ساز هاي عصبي به ميزان سبب بهبود حرکات ارادي و Stem Cell Grafting Improves Both Motor and Cognitive Impairments in a Genetic Model of Parkinson s Disease, the Aphakia (ak) Mouse شدند. شناختي در موش آفاکيا مي شود. دو نوع سلول پرتوان شامل سلول هاي پرتوان القايي توليد شده با Kwon et al., Plos one, January 2014 Volume 9 Issue 1 e85736[55] سلول هاي بنيادي جنيني موشي و سلول هاي پرتوان القايي توليد شده با انتقال پروتئين به نورون هاي دوپامينرژيک تمايز داده شده و از لحاظ خصوصيات تمايزي و پيوند به مدل پارکينسون رت انتقال پروتئين نسبت به سلول هاي بنيادي جنيني درصد بيشتري از نورون ه يا دوپامينرژيک را توليد مي کنند که در مقايسات اپي ژنتيکي و بيان ژن با ريزآرايه مشخص شده که مسير WNT در اين سلول ها فعال تر است. پيوند هر دو نوع سلول سبب بهبود رفتاري پس از هشت Comparative Study of Efficacy of Dopaminergic Neuron Differentiation between Embryonic Stem Cell and Protein-Based Induced Pluripotent Stem Cell با هم مقايسه شدند. هفته شد و توموري مشاهده نشد. سلول هاي پرتوان القايي انساني به نورون هاي Doi et al., Stem Cell Reports,Vol. 2: , March 11, 2014[56] دوپامينرژيک تمايز يافته و در روز 12 پس از تمايز با استفاده از بيان سلول هاي جداسازي شده ميزان بيشتري از ژن هاي دوپامينرژيکي همانند lmx و )41 foxa2 درصد در مقابل 41 درصد( را بيان مي کردند و پيوند آنها سبب بهبود حرکات در حيوان مي شود و تومور مشاهده نشد. CORIN جداسازي شده و در روز 28 و 42 به مدل پارکينسون رت پيوند شدند. و پيش سازهاي جداسازي شده از لحاظ بيان Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation ژن با استفاده از ريزآرايه با هم مقايسه شدند. 32

33 2-2- بيماري ام.اس بيماري ام.اس MS) (Multiple Sclerosis- يک بيماري خود ايمني درگير کننده سيستم عصبي مرکزي است که اصليترين مشخصه آن از بين رفتن غالف ميلين و اختالل در هدايت سيگنالهاي عصبي است که به طور ثانويه به از دست رفتن آکسونها و پيشرفت بدون بازگشت بيماري منجر ميشود. از عوارض شناختي اين بيما ير که در 51 تا 41 درصد بيماران ديده مي شود مي توان به اشکاالت توجه کاهش سرعت پردازش اطالعات حافظه مرتبط با توالي اتفاقات انتخاب کلمات در گفتار پردازش اطالعات بينايي-فضايي ضعف در تصميم گيري و قضاوت و مشکل در برنامه ريزي کارها اشاره اجرايي کرد. اين بيماري معموال در اوايل به صورت دورههاي عود و بهبود )Relapsing-Remitting( ديده ميشود که در آن پس از حمله حاد بيماري و آسيب ميلين عواض ناشي از آن فروکش کرده و ترميم ميلين به صورت درونزاد بروز مي نمايد. با تکرار حمالت به تدريج توان ترميمي درونزاد مغز تحليل رفته پالکهاي بدون ميلين در مغز باقي مانده و به تدريج افزايش مييابند و در نتيجه بيماري وارد مرحله مزمن و پيش رونده مي شود. به دليل پيدايش و گسترش مناطق داراي آسيب ميلين هدايت پيامهاي عصبي دچار اختالل شده و منجر به انواع عوارض حسي حرکتي شناختي و... ميشود. درمانهاي امروزي اغلب جنبه خود ايمني بيماري و کنترل التهاب را هدف قرار داده اند اما توفيق قابل توجهي در خصوص ترميم ميلين يا توقف بيماري نداشته اند. با توجه به پاتولوژي خاص بيماري درمان هاي آتي بايد عالوه بر کنترل پاسخ هايي ايمني محافظت مستقيم سلول هاي اليگودندرسيت افزايش دوره بقاي اکسون فاقد ميلين تا زمان ترميم آن تقويت سلولهاي پيشساز و بنيادي درون بافت مغز از لحاظ تعداد مهاجرت و تمايز موثر و همچنين پيوند توليد سلولهاي ميلين ساز جديد با منشا پيوندي را مدنظر قرار دهند. در اين بيماري حداقل تا قبل از دژنراسيون وسيع آکسونها يک جمعيت هموژن از سلولها )اليگودندروسيتها( تخريب ميشوند که خود اين مسئله بيماري را براي اهداف سلول درماني داراي جاذبه 33

34 نموده است. هر چند ماهيت منتشر آن مانند بيماري ALS شرايط را تا حدي پيچيده تر از شرايط بيماريهايي مانند پارکينسون نموده است. مطالعات نوروبيولوژيک بافت مغز نشان داده است که سلولهاي پيش ساز اليگودندروسيت فراوانترين نوع سلول پيش ساز در مغز بالغين و حتي در جنين در ميانه دوره حاملگي است ]11-54[. اين موضوع عالوه بر اينکه امکان جداسازي و تکثير آنها را به عنوان يک منبع براي تهيه سلولهاي پيوندي فراهم نموده است مؤيد مناسب بودن محيط درون سيستم عصبي مرکزي براي بقاي اين نوع سلولهاست. سلولهاي پيش ساز اليگودندروسيت انساني پس از جداسازي از مغز تکثير آزمايشگاهي و پيوند به مدل حيواني )دميليناسيون ناشي از ليزولسيتين( قادر به بلوغ سريع و ميلين سازي بودند هرچند کارآيي کمتري از سلولهاي مشابه جدا شده از مغز جنين داشتند ]11, 12[. پيوند سيستميک سلول هاي پيش ساز عصبي به موش مدل بيماري اماس (Experimental allergic EAE) encephalomyelitis- درجاتي از جايگيري سلولها در محل آسيب و تمايز به.]13[ اليگودندروسيت بالغ و ميلين ساز را نشان داده است اين يافته ها مجددا توانايي سلولهاي پيش ساز و بنيادي عصبي را بر تمايز و ميلينسازي در مناطق آسيب ديده مغز و نخاع نشان ميدهد. عالوه بر پيش سازهاي اليگودندروسيت و سلولهاي بنيادي عصبي سلولهاي پيش ساز عصبي نيز در پاسخ به التهاب و آسيب ميلين با تکثير مهاجرت و تمايز مناسب ميتوانند به سلولهاي ميلين ساز تبديل شوند تاکنون از غني سازي محيط و جايگزيني سلولهاي از دست رفته به عنوان دو راهبرد کلي سلول درماني نام برده شد اما با توجه به پاتوفيزيولوژي بيماري اماس راهبرد سومي نيز براي آن مورد نظر قرار گرفته است که آن تعديل پاسخهاي ايمني بوده است. سه دسته کلي از سلولها براي سلول درماني بيماري اماس مورد توجه اند که از نظر مکانيزم عملکرد و منشا استخراج متفاوتند. اولين گروه سلولهاي ميلين ساز سيستم عصبي محيطي است. اين سلولها شامل سلولهاي شوان و سلولهاي پيشساز ستيغ عصبي ميباشند که بيشتر با هدف فراهم آوردن محيط غني از طريق ترشح فاکتور رشد و در نتيجه 34

35 تقويت ترميم دورنزاد مورد توجه بودهاند. گروه دوم سلولها سلولهاي پيش ساز و بنيادي استخراج شده از مغز و نخاع ميباشند. اين سلولها عالوه براينکه به صورت موفقيت آميزي از بافت مغز بزرگساالن و بافت مغز جنين هاي سقط شده قابل استخراج اند امروزه به راحتي از سلول هاي پرتوان جنيني و پرتوان القايي نيز قابل تهيهاند. گروه سوم سلولها سلولهاي بنيادي مزانشيمي هستند. اين سلولها با هدف جايگزيني سلولهاي از دست رفته استفاده نميشوند و معموال به خاطر اثرات تعديل ايمني قوي و اثرات تروفيک مورد توجهاند. نکته ديگر در مورد اين سلولها بي خطر يا کم خطر بودن آنهاست. تا زمان نگارش اين متن 28 کارآزمايي باليني در خصوص سلول درماني اين بيماري به ثبت رسيده است که يک مورد آن نيز در ايران در حال انجام است. اميد است جمع آوري نتايج اين مطالعات راهکار درماني قابل قبولي را براي سلول درماني بيماران ام.اس پيشنهاد نمايد. جدول شماره 5 خالصه مطالعات انجام شده در خصوص کاربرد سلولهاي بنيادي در درمان بيماري ام.اس را نشان مي دهد. جدول شماره : 2 مطالعات مربوط به کاربرد سلولهاي بنيادي در بيماري ام.اس عنوان روش مطالعه نتايج مجله و سال Carreras et al., 2003, Haematologica[ 64] سلولهاي بنيادي خونساز بر اساس نشانگر CD34 از خون محيطي 15 بيمار جدا شده و در کارآزمايي باليني فاز 2 به خود بيماران پيوند شده است. اين نوع سلول ها ميزان قابل قبولي از سميت را دارند و به وضوح پيش روي بيماري ام.اس را کاهش مي دهند CD34+ selected autologous peripheral blood stem cell transplantation for multiple sclerosis: report of toxicity and treatment results at one year of follow-up in 15 patients Windrem et al., Nat Med Jan;10(1):93-7[65] سلول هاي پيش ساز اليگودندروسيت از مغز قدامي جنين هاي 21 تا 23 هفته انساني با استفاده از FACS سلول هاي پيش ساز اليگودندروسيت جنيني پس از 12 هفته ميلين سازي کردند و آکسون ها را مي پوشانند اما سلول هاي پيش ساز اليگودندروسيت مغز Fetal and adult human oligodendrocyte progenitor cell isolates myelinate the congenitally dysmyelinated brain 35

36 براي A2B5 وانتخاب منفي بالغ زودتر و در هفته چهارم اين کار را براي CD56 جداسازي شدند انجام داد و همچنين زودتر به و همين سلول ها از مغز بالغ اليگودندروسيت بالغ تمايز يافته و تعداد انسان نيز با استفاده از بيان بيشتري آکسون را مي پوشانند. A2B5 جداسازي شدند و در مغز موش هاي تازه متولد شده مدل MS پيوند شدند. نتايج نشان ميدهد که سلول هاي بنيادي به اليگودندروسيت تمايز مي دهند و پس از 42 روز سلول هاي مثبت براي A2B5 Keirstead et al., The Journal of Neuroscience, 2005, 25(19): [66] سلول هاي بنيادي جنيني به سلول هاي پيش ساز و بالغ اليگودندروسيت تمايز يافتند و سپس 4 روز پس از تخريب نخاع و 11 ماه پس از آن پيوند شدند. که باالي 38 درصد جمعيتي از کلني ها را تشکيل مي دادند به مدل پيوند شدند. پيوند سلول هاي OPC در روز 4 پس از ايجاد ضايعه نشان داد که سلول ها بالغ شده و ميلين سازي مي کنند و حرکت حيوان بهتر مي شد. اما در پيوند پس از Human Embryonic Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Progenitor Cell Transplants Remyelinate and Restore Locomotion after Spinal Cord Injury 11 ماه اگرچه سلول ها بالغ مي شوند ولي ميلين سازي جديد وجود ندارد و بهبود رفتاري مشاهده نشد. Nistor et al., Glia Feb;49(3):385-96[67] معرفي اولين پروتکل تمايز سلول هاي بنيادي جنيني انساني به سلول هاي اليگودندروسيت در آزمايشگاه و پيوند سلول ها به مدل موش shiverer سلول هاي پيش ساز به دست آمده قابل پاساژ بوده و پس از انتخاب به روش مکانيکي و به روش انتخاب مثبت قادر به تمايز به اليگودندروگليا بودند. اين سلول ها پس از پيوند قادر به توليد ميلين فشرده و در نتيجه بهبود حرکات در حيوان مدل بودند. Human embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes in high purity and myelinate after spinal cord transplantation Cayre et al., Molecular and Cellular Neuroscience, Volume 31, Issue 4, 2006, [68] نتايج نشان داد که سلول هاي ناحيه SVZ در خارج از مسير مهاجرتي قدامي پس از پيوند در مدل shiverer پس از 22 روز به اليگودندروسيت تمايز يافته و سلول هاي بنيادي عصبي از ناحيه SVZ استخراج شدند و مهاجرت آنها در خارج از جريان قدامي مهاجرتي مورد بررسي قرار گرفت. Migrating and myelinating potential of subventricular zone neural progenitor cells in white matter tracts of the adult rodent brain Nait-Oumesmar et al., PNAS ;104(11):4694-9[69]. مغز بيماران مبتال به MS پس از مرگ جهت تکثير و مهاجرت سلول هاي ناحيه SVZ مورد مطالعه قرار گرفته است. تکثير سلولي براي سلول هاي مثبت NCAM و GFAP به ميزان دو تا سه برابر بيشتر در ناحيه SVZ نسبت به مغز سالم مشاهده شدند. اين سلول ها به ميزان زيادي SOX9 را بيان مي کنند و Activation of the subventricular zone in multiple sclerosis: Evidence for early glial progenitors 31

37 به ميزان کمتري SOX10 و OLIG2 را بيان مي کنند. همچنين در نواحي فعال بيماري تعداد پيش سازها 31 تا 51 درصد بيشتر از نواحي خاموش بيماري است. اين مطالعه نشان مي دهد که گليازايي در بيماري MS از SCZ آغاز مي شود. براي تمايز سلول هاي بنيادي سلول هاي پيش ساز اليگودندروسيت به جنيني انساني از محيط داراي دست آمده با اين روش قابل نگهداري و Izrael et al., Mol Cell Neurosci Mar;34(3):310-23[70] پاساژ در آزمايشگاه هستند و مي توانند به اليگودندروسيت تمايز دهند و پس از پيوند پيش سازهايي که در مراحل اوليه تمايز با Noggin تيمار شده اند به ميزان بيشتري قادر به ساخت ميلين در محيط ارگانوتروپيک و در محيط مغز اسيد رتينوئيک و Noggin به صورت مرحله اي استفاده شده تا بيان ژن هاي OLIG2 SOX10 و NKX2.2 به حداکثر برسد. پيش سازهاي تمايز يافته در مدل موش Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. shiverer پيوند شدند. موش هستند. Windrem et al., Cell stem cell, Vol 2, Issue 6, 2008, [71] پيوند اين سلول ها توانست ميزان مرگ در موش ها را کاهش دهد و با سيستم تزريق در چند ناحيه ميلين سازي در نيمکره ها ساقه مغز و مخچه اتفاق افتاده بود. گره هاي رانويه تشکيل شده بودند و مغز موش به صورت شيمري از سلول هاي انساني درآمده بود و بهبود رفتار و حرکت در حيوان مشاهده شده است. سلول هاي گليا از مغز جنين هاي انساني 13 تا 22 هفته اي با استفاده از مارکرهاي NCAM و A2B5 جداسازي شدند و در موش هاي shiverer که سيستم ايمني ندارند )- )rag2 پيوند شدند. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse سلول هاي پيش ساز Cao et al., The Journal of Neuroscience, 2010, 30(8): [72] زنده ماني سلول هايي که با CNTF تراريخت شده بودند چهار برابر بيشتر از گروه کنترل بود. اين سلول ها ميلين سازي کرده بودند و تست هاي رفتاري بهبودي محسوسي را نشان داد. اليگودندروسيت گرفته شده از نخاع که با استفاده از وکتورهاي ويروسي براي بيان CNTF تراريخت شده بودند 3 روز پس از ايجاد مدل قطع نخاع پيوند شدند و قدرت ميلين سازي آنها مورد بررسي Transplantation of Ciliary Neurotrophic Factor- Expressing Adult Oligodendrocyte Precursor Cells Promotes Remyelination and Functional Recovery after SpinalCord Injury قرار گرفت. Exp Neurol Jul;230(1):16-26[73] در مدل موشي EAE سلولهاي پيش ساز عصبي پيوند شده و مهاجرت تمايز و زنده ماني سلول ها پس از پيوند مورد بررسي قرار گرفته سلول ها پس از پيوند در فاز هاي مختلف پيوند رفتار هاي متفاوتي دارند و در فاز حاد بيماري تعداد کمي از سلول ها تمايز گليالي دارند در صورتي که در فاز مزمن تعداد بيشتري تمايز مي دهند. نتايج Time-dependent fate of transplanted neural precursor cells in experimental autoimmune encephalomyelitis mice 34

38 است. نشان داد که التهاب سبب مهاجرت بيشتر سلول ها مي شود. اين مطالعه نشان داد که سلول هاي پيش ساز اليگودندروسيت را مي توان با استفاده از بيان CD140a که يک اپي توپ از PDGFR آلفا است جداسازي کرد و اين يک جمعيت خاص از سلول سلول ها ژن Olig2 را بيان ميکنند و در Sim et al., Nat Biotechnol. 2011;29(10):934-41[74] سه ماهه سوم تکوين به وجود مي آيند. فقط قسمتي از سلول هاي که A2B5 را هاي پيش ساز اليگودندروسيت از مغز جنين هاي انساني 15 تا بيان مي کنند CD140a را بيان مي کنند. سلول هاي مثبت براي CD140a به اليگودندروسيت و آستروسيت تمايز مي يابند و بيان ژن نشان داد که اين سلول ها 22 هفته جداسازي شده و پس از تعيين خصوصيات آن و بررسي بيان ژن آنها با ريزآرايه به موش هاي مدل shiverer CD140a identifies a population of highly myelinogenic, migrationcompetent and efficiently engrafting human oligodendrocyte progenitor cells CD9 را نيز بيان مي کنند و سلول هاي پيوند شدند. که هر دو مارکر را بيان مي کنند پس از پيوند قادر به ساخت ميلين با وسعت بيشتري در 8 و 12 هفته نسبت به سلول هاي A2B5 مثبت بودند. Uchida et al., Sci Transl Med 2012: Vol. 4, Issue 155, p. 155ra136[75] سلول هاي بنيادي عصبي انساني کشت شده در محيط Shivererimmunodeficient (Shi- آزمايشگاه به مدل id) پس از تولد و در جواني پيوند شدند. در هر دوگروه موش هاي پيوندي سلول ها به اليگودندروسيت تمايز يافته و ميلين طبيعي را با ساختار مناسب ساختند. مطالعات بافت شناسي و MRI پس از 5 تا 4 هفته نشان داد که ميلين سازي در هر دو گروه )پس از تولد و موش هاي جوان( يکسان است. Human Neural Stem Cells Induce Functional Myelination in Mice with Severe Dysmyelination Wang et al., cell stem cell, Volume 12, Issue 2, 2013, [76] سلول هاي پرتوان با درصد هاي متغيير به سلول هاي پيش ساز اليگودندروسيتي )تا 41 درصد( با يک پروتکل 1 مرحله اي تمايز يافتند اين سلول ها در محيط ازمايشگاهي قادر به ساخت ميلين بودند و پس از پيوند پس از سه ماه توانايي تمايز به اليگودندروسيت و آستروسيت ها را داشتند و در مقايسه با سلول هاي CD140 مثبت جنيني عملکرد بهتري سلول هاي سه الين پرتوان القايي و يک الين جنيني به سلول هاي پيش ساز اليگودندروسيت تمايز يافتند و در موش هاي تازه متولد شده مدل shiverer به همراه سلول هاي OPC مغز جنين انسان پيوند شدند و مقايسه شدند. داشتند. Human ipsc-derived Oligodendrocyte Progenitor Cells Can Myelinate and Rescue a Mouse Model of Congenital Hypomyelination Windrem et al., The Journal of Neuroscience, 2014, 34(48): سلول هاي پيش ساز اليگودندروسيت از جنين هاي انساني سه ماهه دوم با توجه سلول هاي پيش ساز پيوند شده پس از سه ماه بيشتر به ناحيه مغز قدامي مهاجرت کردند و سلول هاي NG2 A Competitive Advantage by Neonatally Engrafted Human Glial Progenitors Yields Mice Whose Brains 38

39 مثبت انساني جايگزين سلول هاي موشي [77]16161 شدند. پس از هشت ماه سلول هاي پيوند شده به اليه هاي بااليي مغز مهاجرت کردند و پس از يکسال کليه پيش سازهاي موشي به وسيله سلول هاي انساني در مغز قدامي جايگزين شدند. سلول هاي انساني بسته به قسمت هايي از مغز که مهاجرت مي کنند به اليگودندروسيت و يا آستروسيت تمايز مي دهند و يا در حالت پيش سازي باقي مي مانند. به بيان A2B5 و عدم بيان MACS با NCAM جداسازي شدند. اين سلول ها به مدت دو هفته در محيط آزمايشگاه نگهداري شده و سپس به مدل موش shiverer که سيستم ايمني ندارند )- )rag2 پيوند شدند. Are Chimeric for Human Glia 3-2 بيماري آلزايمر آلزايمر فراوانترين بيماري نورودژنراتيو و اصليترين علت زوال عقل است. اين بيماري با کاهش توان شناختي و اختالل حافظه شناخته ميشود. با پيشرفت بيماري تعداد زيادي از نورونها و سيناپسهاي آن ها در کورتکس هيپوکامپ آميگدال و قاعده مغز از بين ميرود. گرچه پاتولوژي کامل بيماري هنوز ناشناخته است تشکيل پالکهاي بتا-آميلوئيدي plaques) (β-amyloid و ايجاد رسوبات نوروفيبريلي tangles) (Neurofibrillary اصليترين شاخصههاي اين بيمارياند. اين بيماري غالبا در پيري از 15 سالگي شروع ميشود و لذا با افزايش ميانگين سني جمعيت فراواني و هزينههاي آن در جامعه افزايش مييابد. درمانهاي فصلي اين بيماري بر تنظيم فعاليت نوروترانسميترها استوار است. افزايش عملکرد سيستم کولينرژيک اختالالت شناختي و حافظه بيماران را بهبود ميبخشد و اين اميد را فراهم آورده است که توليد و کاربرد سلولهاي کولينرژيک مشتق از سلولهاي بنيادي در درمان اين بيماري موثر باشد. اين بيماري با کاهش نوروژنز در هيپوکامپ همراه است و سلول درماني با هدف افزايش نوروژنز در اثر فعال- سازي سلولهاي بنيادي درونزاد و يا جايگزيني سلولهاي از دست رفته ممکن است پيشرفت بيماري را 33

40 کاهش داده يا متوقف نمايد. سلولهاي بنيادي درونزاد را ميتوان به وسيله فاکتورهاي شيميايي همانند آلوپرگنانولون )Allopregnanolone( فلوکستين )Fluoxetine( فاکتور محرک گرانولوسيتها )-G AMD3100 )CSF و فاکتور مشتق از سلولهاي استرومايي تحريک کرد که منجر به حفاظت نوروني ميشود,48[.]43 مطالعات اخير نشان ميدهد که با استفاده از پيوند سلولهاي بنيادي حاصل از بند ناف انسان ]81, ]82 81[ سلولهاي اپيتليال و مزانشيم ]81, مشتق از پرده آمنيوتيک در مغز حيوانات مدل تراريخت آلزايمر عالئم بيماري بهبود مييابد. استفاده از اين سلولها کارايي حافظه و شناخت را باال ميبرد و در نتيجه با کاهش ميزان پالکهاي آميلوئيدي و کاهش فعاليت ميکروگلياها سبب افزايش بقاي نورونها ميشود. بيشتر کارهاي انجام شده در مورد سلول درماني بيماري آلزايمر پيوند سلولهاي مزانشيمي از منابع مختلف است که با مکانيسمهاي مختلف از جمله افزايش فعاليت متابوليکي افزايش بيان نپريليزين )neprilysine( در سلولهاي ميکروگليا و تخريب بتا-آميلوئيد کاهش رسوب بتا-آيلوئيد کاهش سطح فاکتورهاي پيش التهابي ميتواند به بقاي نورونها کمک کرده و در بهبود عالئم بيماري آلزايمر نقش ايفا کند. در مدلهاي بيماري آلزايمر ايجاد شده در جوندگان پيوند سلولهاي پيش ساز عصبي باعث افزايش BDNF دانستيه سين ساپ ها و افزايش کارکرد شناختي با افزايش توليد درونزاد ميگردد. استفاده از فيبروبالست بيماران پس از دستکاري ژنتيکي به منظور توليد NGF اکنون مرحله يک کارآزمايي باليني را گذرانده است ]83[. به نظر ميرسد برخي از اثرات مثبت اين کارآزمايي نتيجه جايگيري فيبروبالست- هاي مولد NGF در اصليترين مرکز کولينرژيک در عقدههاي قاعدهاي باشد. کمپايي دانمارکي NsGene در حال توليد و معرفي درماني بر مبناي کاربرد سلول هاي مولد عوامل تروفيک بصورت کپسوله شده مي باشد. عليرغم اميدها براي استفاده از سلول درماني براي بيماري آلزايمر گسترده بودن 41

41 و پراکنده بودن منطقه آسيب در اين بيماري شرايط پيچيدهتري را براي اينگونه درمانها پيش روي محققين نهاده است. با اين حال تا کنون هفت کارآزمايي باليني با استفاده از سلولهاي بنيادي براي اين بيماري به ثبت رسيده است. 1 جدول شماره خالصه مطالعات سلول درماني در بيماري آلزايمر را نشان مي دهد. جدول شماره 1: مطالعات مربوط به کاربرد سلولهاي بنيادي در بيماري آلزايمر عنوان روش مطالعه نتايج مجله و سال Shin et al., 2011, Stem cells 29: [78] حافظه در موش هاي آلزايمري بهبود يافت ولي تغييري در پالک هاي ايجاد شده مشاهده نشد. با نشاندار کردن سلول هاي مغز استخوان نشان دادند که سلول هاي ميکروگلياي مغز حاصل از مهاجرت سلو لهاي مغز استخوان هستند و نورون زايي و بهبود حافظه فقط در موش هايي که GCSF و SDF1a را دريافت کرده بودند مشاهده شد. سلول هاي انساني در معرض اسيد از GCSF و SDF1a استفاده شده است تا با اين روش سلول هاي خونساز مغز استخوان به مغز موش مهاجرت کنند و سپس تست هاي حافظه و وجود پالک هاي آميلوئيد در مغز موش هاي آلزايمري بررسي شده است. Combined Effects of Hematopoietic Progenitor Cell Mobilization from Bone Marrow by Granulocyte Colony Stimulating Factor and AMD3100 and Chemotaxis into the Brain Using Stromal Cell-Derived Factor-1a in an Alzheimer s Disease Mouse Model. Zilka et al., Neuroscience Oct 13;193:330-7[84] رتينوئيک قرار داده شده و سپس با داکسي ساکلين القا شده تا پروتئين ناقص tau را بسازند و وارد مرگ سلولي شوند سپس اين سلول ها با سلول هاي مزانشيمي هم کشتي شده و يا در مجاورت ترشحات اين سلول ها قرار گرفتند. نتايج نشان داد که بدون اينکه بيان پروتئين tau تغيير کند سلولهاي مزانشيمي و يا ترشحات آنها توانستند از از سلولهاي انساني استفاده شده و سلول ها به صورت القاپذير براي پروتئين ناقص tau تراريخت شدند و اثرات سلول هاي مزانشيمي و يا ترشحات اين سلول ها بر روي زنده ماني و رشد سلول هاي مدل آلزايمر بررسي شده است. Mesenchymal stem cells rescue the Alzheimer s disease cell model from cell death induced by misfolded truncated tau مرگ سلولي جلوگيري کنند. Chang et al., Neurochem Int Nov;61(6):885-91[85] نقش ماده ضد افسردگي فلوکستين بر روي بقا و تکثير و تمايز سلول هاي بنيادي عصبي در مدل آلزايمر بررسي شده است. فلوکستين تکثير سلول هاي عصبي درونزاد را در مدل آلزايمر افزايش داد و تمايز آنها را به سمت نورون هاي بالغ نسبت به سلول هاي گليا افزايش داد و همچنين سبب محافظت نوروني مرتبط با Therapeutic potentials of neural stem cells treated with floxetine in Alzheimer s disease 41

42 سلول هاي بنيادي مزانشيمي بند ناف در حضور بتا-آميلوئيد با سلول هاي ميکروگليا هم کشتي داده شدند. و سلول هاي مزانشيمي به هيپوکمپ رت نيز پيوند شدند. پالک هاي آميلوئيدي شد. نتايج هم کشتي نشان داد که ميزان بيان آنزيم نپريليزين در ميکروگليا افزايش يافت و بررسي سايتوکين ها نشان داد که سلولهاي مزانشيمي پروتئين sicam1 را مي سازند که سبب اين فعاليت در ميکروگليا مي شود. و زماني که سلول هاي مزانشيمي و يا پروتئين ICAM1 به مغز رت ها پيوند مي شوند بيان نپريليزين در مغز افزايش يافته و پالک ها کمتر تشکيل مي شوند. Kim et al., Cell Death Differ Apr;19(4):680-91[80] Magga et al., J Cell Mol Med May;16(5): [86] Soluble intracellular adhesion molecule-1 secreted by human umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cell reduces amyloid-β plaques. Production of monocytic cells from bone marrow stem cells: therapeutic usage in Alzheimer's disease سلول هاي بنيادي خونساز حاصل از مغز استخوان با استفاده از فاکتور محرک کلني ماکروفاژ )MCSF( به سلو لهاي مونوسيت تمايز يافتند و در مدل آلزايمر بررسي شدند. سلول هاي بنيادي مغز موش براي ژن متالوپروتئيناز 3 )MMP( تراريخت شدند و سپس به مدل آلزايمر پيوند شدند. سلول هاي مونوسيت تمايز يافته ژن هاي مونوسيتي را بيان مي کردند و به سايتوکين ها پاسخ مي دادند. اين سلول ها قادر به حذف بتا-آميلوئيد چه در آزمايشگاه و پس از پيوند به اندازه ميکروگلياها هستند. سلولهاي عصبي پيوند شده قادر نبودند که به محل پالک ها مهاجرت کنند و عالرغم اين در محل پالک ها بيان باالي Njie et al., PLoS One. 2012;7(4):e3409 7[87] MMP9 مشاهده شد که به نظر نميرسد A Preclinical Assessment of Neural Stem Cells as Delivery Vehicles for Anti- Amyloid Thrapeutics. سلول هاي اپي تليالي حاصل از مايع آمنيوتيک به موش هاي مدل ژنتيکي آلزايمر پيوند شدند. که در اثر سلول هاي عصبي پيوند شده باشد.اما سلول هاي پيوند شده تشکيل مناطقي را مي دهند و تا 2 ماه در بافت باقي مانده بودند. سلول هاي پيوندي تا 8 هفته زنده مانده و به ديواره بطن سوم مهاجرت کردند. نتايج نشان دهنده افزايش سطح استيل کولين در مغز و پايانه هاي کولينرژيک بود و سبب بهبود حافظه شد. Xue et al., Sci China Life Sci Feb;55(2):132-40[88] Ma et al., Cell Transplant. 2013;22 Suppl 1:S113-26[89] Thrapeutic effects of human amniotic epithelial cell transplantation on doubletransgenic mice coexpressing APPswe and PS1ΔE9- deleted genes Intracerebral transplantation of adiposederived mesenchymal stem cells alternatively activates microglia and ameliorates neuropathological deficits in Alzheimer's disease mice سلول هاي مزانشيمي حاصل از بافت چربي در مدل حيواني APP/PS1 پيوند شدند. سلولهاي پيوند شده ميزان پالک ها را کاهش دادند و حافظه و رفتار حيوان مدل بهبود يافت. مکانيسم بهبودي فعال شدن ميکروگلياها و ترشح فاکتورهاي ضد التهابي گزارش شده است. Bae et al., Curr بررسي تزريق داخل مغز سلول نتايج حاصل نشان داد که پالک هاي Bone marrow-derived 42

43 Alzheimer Res Jun;10(5):524-31[82] Yang et al., Stem Cell Res Ther Jul 4;4(4):76[90] هاي بنيادي مزانشيمي مغز استخوان در مدل جوان آلزايمر که منجر به عوارض شناختي نشده است. سلولهاي مزانشيمي ژل وارتان با استفاده از ماده D609 به سلول هاي شبه عصبي تمايز يافتند و در مدل ژنتيکي آلزايمر پيوند شدند. آميلوئيدي کمتري در مقايسه با گروه کنترل در مغز تشکيل شده و بيان سيناپسين و داينامين که در آلزايمر کاهش مي يابد در مدل پيوندي افزايش داشت. پيوند سلول هاي عصبي حاصل از سلول هاي مزانشيمي باعث بهبودي شناخت در مدل شده و تشکيل پالک ها را کم کرد و با ترشح فاکتورهاي ضد التهابي مثل IL4 و سرکوب بيان IL-1b و TNF-a سبب فعال شدن ميکروگلياها مي شود. mesenchymal stem cells contribute to the reduction of amyloid-β deposits and the improvement of synaptic transmission in a mouse model of predementia Alzheimer's disease Human umbilical cord mesenchymal stem cellderived neuron-like cells rescue memory deficits and reduce amyloid-beta deposition in an AβPP/PS1 transgenic mouse model. 2-2 بيماري هانتينگتون بيماري هانيتنگتون disease) (Huntingtons يک بيماري ژنتيکي و نتيجه تجمع تکرارهاي CAG در ژن هانتينگتون و در نتيجه تکرارهاي پلي گلوتامين در آن است. شروع بيماري در دهههاي تا 5 زندگي است و دوره بيماري تا سال طول ميکشد. اين بيماري با حرکات غير اداري زوال عقل تغييرات شخصيتي و اختالالت شناختي همراه است که حاصل تخريب نورون هاي گاباارژيک در استرياتوم و دژنراسيون قشر مغز ساقه مغز و هيپوکامپ است. اختالل حافظه ضعف در برقراري ارتباط و هوشيا ير از جمله عوارض شناختي آن است. در عين حال مکانيزم و درمان هاي بيماري ناشناخته است. درمان سلولي اين بيماري در سالهاي اخير مورد توجه قرار گرفته است. در حال حاضر تمرکز بر سلول درماني اين بيماري براساس راهبردهايي که فاکتورهاي رشد را به محل ضايعه برساند و باعث حفاظت نوروني شود صورت گرفته است. اغلب کارها در مدلهاي حيواني اين بيماري انجام شده است. پيوند سلولهاي بنيادي مزانشيمي انساني با اثر بر سلول هاي درونزاد در استرياتوم موشهاي مدل بيماري باعث تکثير فراخوان و تمايز به نورون آنها و همچنين ممانعت از آتروفي نورونها شد ]31[. در 43

44 مطالعه ديگر پيوند سلولهاي بنيادي انساني به مغز موشهاي صحرايي مدل بيماري اختالالت حرکتي را از طريق مکانيزم هاي تروفيک کاهش داد ]32[. تزريق داخل وريدي سلول هاي بنيادي عصبي انساني به مدل بيماري در جوندگان باعث مهاجرت آن ها به استرياتوم کاهش آتروفي استرياتوم و مشارکت آنها منجر به بهبود عملکرد حيوان شد ]33, 34[. در يک مطالعه آزمايشگاهي سلولهاي بنيادي عصبي انساني به موشهاي صحرايي پيوند شدند. نتايج اين مطالعه بهبود عملکرد حيوانات مدل را به دنبال پيوند سلول- هاي بنيادي عصبي مستخرج از کورتکس جنين انسان نشان داد. اضافه کردن CNTF به محيط کشت اين سلولها در طي دوره قبل از پيوند کارآيي پيوند را بصورت محسوس افزايش داد ]35[. جدول شماره 4 خالصه مطالعات انجام شده در خصوص کاربرد سلولهاي بنيادي در درمان هانتينگتون را نشان مي دهد. جدول شماره : 7 مطالعات مربوط به کاربرد سلولهاي بنيادي در بيماري هانتينگتون عنوان روش مطالعه نتايج مجله و سال Bachoud-Levi et al., 2000, The Lancet 356: [96] McBride et al., J Comp Neurol Jul 19;475(2):211-9[97] نتايج اسکن PET نشان دهنده فعاليت متابوليکي باال در 3 بيمار بود و شناخت بيماران و حرکات آنها بهبود يافته بود. تست رفتاري نشان داد که پس از 8 هفته بهبودي حاصل شده است و حجم جسم مخط ط در گروه سلولي داراي CNTF به ميزان 22 درصد بيشتر است. سلول هاي عصبي پس از پيوندد زنده مانده و به مناطق ديگري از هسته هاي قاعده اي مهاجرت کرده اند. اي سلول ها توانسته بودند به نورون و آستروسيت تمايز يابند. پيوند نوروبالست هاي جنين انسان در جسم مخطط 5 بيمار هانتينگتوني سلولهاي بنيادي عصبي حاصل از جنين هاي انساني )12 هفته( پس از کشت در حضور CNTF و عدم حضور اين فاکتور به رت هاي مدل هانتينگتون که با اسيد کوئينولينيک جسم مخطط آنها تخريب شده به تعداد 211 هزار سلول پيوند شدند. Motor and cognitive improvements in patients with Huntington's disease after neural transplantation. Human neural stem cell transplants improve motor function in a rat model of Huntington's disease Gaura et al., 2004, Brain 127: 65 72[97] نتايج اسکن ها نشان داد که در مطالعه Bachoud-Levi و همکاران مکانيسم بهبودي در بيماران از طريق کاهش هيپومتابوليسم )در واقع پيوند نوروبالست هاي جنين انسان در جسم مخطط 5 بيمار هانتينگتوني Striatal neural grafting improves cortical metabolism in Huntington's disease patients 44

45 Bachoud-Levi et al.,2006, Lancet Neurol. 5: 303 9[98] Krystkowiak et al., PLoS One Jan 24;2(1):e166[9 9] Lorincz et al., Mol Cell Neurosci Jan;40(1):1-13[100] Mu et al., PLoS One Jul 23;9(7):e [101] پيوند نوروبالست هاي جنين انسان در جسم مخطط 5 بيمار هانتينگتوني پس از 1 سال سلول هاي بنيادي عصبي از مغز جنين هاي انساني به صورت کلينيکي به 13 بيمار هانتينگتوني پيوند شدند. سلول هاي بنيادي عصبي حاصل از مغز موش هاي مدل ژنتيکي هانتينگتون در محيط آزمايشگاه مورد بررسي قرار گرفتند. سلول هاي پرتوان القايي موشي در ناحيه جسم مخطط مدل اسيد کوئينولينيک پيوند شدند و با استفاده از اسکن PET بررسي شدند. افزايش فعاليت متابوليکي( در جسم مخطط و کورتکس بوده است. نتايج نشان داد که از لحاظ کلينيکي پيوند سلول تا دو سال سبب بهبودي شده و پس از آن اثرات پيوند شروع به کم شدن مي کند. ديستونيا رو به وخامت نهاده اما کورئا ثابت مانده است. در يکي از بيماران که سيکلوسپورين را مصرف نکرده بود سيستن ايمني فعال شده و به سلول هاي پيوندي واکنش نشان داده است. سلول هاي بنيادي عصبي حاصل از مدل هانتينگتون نسبت به ديگر سلول هاي بنيادي عصبي به ميزان بيشتري نورون مي سازند و تکرارهاي CAG شايد در اين مسئله دخالت داشته باشند. سلول هاي پيوند شده بعد از 1 هفته به نورون ها و گليا تمايز يافته بودند و در اسکن ميزان اجتماع 18 F-FDG بيشتر شده بود. حافظه و يادگيري حيوانات نيز بهبود يافته بود. Effect of fetal neural transplants in patients with Huntington's disease 6 years after surgery: a long-term follow-up study Alloimmunisation to donor antigens and immune rejection following foetal neural grafts to the brain in patients with Huntington's disease Expanded CAG repeats in the murine Huntington's disease gene increases neuronal differentiation of embryonic and neural stem cells Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cells Improves Functional Recovery in Huntington's Disease Rat Model 2-2 جمع بندي سلول درماني بيماري هاي نورودژنراتيو همان گونه که در باال اشاره شد براي بيماريه يا مهم سيستم عصبي که شناخت را درگير ميکنند بسته به نوع بيماري و سلولهايي که در بيماري کارايي خود را از دست ميدهند استراتژيه يا مختلفي سلول درماني براي وجود دارد. با نگاه کردن به مقاالت ارائه شده و جداول مربوطه به مطالعات سلول 45

46 بنيادي در هر بيماري و نوع سلوله يا مورد استفاده مي توان تا حدودي رويکرد محققان در درمان اين بيماريها را با استفاده از سلول درماني استنباط کرد. به عنوان مثال در مورد بيماري هانتينگتون مطالعات سلوله يا بنيادي هنوز در آغاز راه است در صورتي که در مورد پارکينسون اين مطالعات تا حد زيادي به MS کلينيک نزديک شده است. در مورد بيماري عالوه بر انواع سلولهاي قابل استخراج از بافت هاي بالغين و جنينهاي سقط شده امکان توليد پيشسازهاي اليگودندروسيت از سلولهاي بنيادي جنيني و سلولهاي پرتوان القايي فراهم آمده است. دگر برنامهريزي مستقيم) Trans-differentiation ( اين سلولها از ساير سلولهاي بيمار نيز در حال تجربه است. به نظر ميرسد محدوديت در تهيه سلول الزم براي سلول درماني در حال برطرف شدن است. در هنگامي که انواعي از سلولها براي درمان يک بيماري در دسترس است انتخاب نوع سلول بايد براساس پاتوفيزيولوژي بيماري و انتظاري که از پيوند سلول داريم صورت گيرد. اگر فقط اثرات غني سازي محيط مورد انتظار است يا جايگزيني سلول مستلزم توليد سلول هاي جديد با ارتباطات گسترده و آکسون زايي دقيق در فاصلهاي طوالني است )که عمال با دانش فعلي غير ممکن است( شايد سلول هاي بنيادي مزانشيمي بهترين گزينه باشد. هر گونه پيوند مستلزم اثبات بي خطر بودن آن در ابتدا و در مدلهاي حيواني و سپس در شرايط تعريف شده کارآزمايي باليني است. امروز به دليل خطرات کم به سلولهاي بنيادي مزانشيمي اقبال زيادي شده است. به نظر ميرسد تا پيوند انواع ديگر سلولهاي چند توان و يا پرتوان و مشتقات آنها به بيمار زمان قابل توجهي باقي مانده است. 41

47 6- توانمندي هاي محققين ايراني در توليد و کاربرد سلولهاي بنيادي در بيماريهاي نورودژنراتيو بر اساس بررسي هاي بعمل آمده در متون و پيگيري از مراکز پيشرو توانمندي داخلي بويژه در حوزه مطالعات پايه در اغلب زمينه ها از جمله در زمينه توليد سلول هاي بنيادي جنيني توليد سلول هاي بنيادي القايي استخراج سلول هاي مزانشيمي مغز استخوان سلول هاي بنيادي هماتوپوئيتيک باز برنامه ريزي مستقيم سلول هاي سوماتيک به سلول هاي بنيادي عصبي باز برنامه ريزي مستقيم آستروسيت هاي مغزي به پيش ساز هاي عصبي توليد سلول هاي پيش ساز عصبي از سلول هاي پرتوان ( جنيني و القايي( توليد سلول هاي پيش ساز اليگودندروسيت از سلول هاي پرتوان) جنيني و القايي( توليد و جداسازي سلول هاي پيش ساز دوپامينرژيک تمايز سلول هاي مزانشيمي به سلول هاي شبه عصبي تمايز سلول هاي مزانشيمي به سلول هاي شبه اليگودندروسيتي پيوند سلول هاي مزانشيمي به مدل هاي حيواني بيماريهاي نورودژنرتيو پيوند سلول هاي پيش ساز عصبي به مدل هاي حيواني بيماريهاي نورودژنرتيو پيوند سلول هاي بنيادي مزانشيمي به بيماري هاي نورودژنرتيو در انسان و... توانمنددي خوبي وجود دارد. جدول شماره 8 پژوهشهاي انجام شده در زمينه سلول هاي بنيادي در ايران و ظرفيت ايران در اين حوزه علمي را نشان ميدهد. در جدول سعي شده است که در هر زمينه به تعدادي از مقاالت چاپ شده اشاره گردد. 44

48 جدول شماره : 8 پژوهش هاي انجام شده در راستاي سلول هاي بنيادي در ايران پژوهش هاي انجام شده در راستاي سلول هاي بنيادي در ايران مرجع ]123,122[ ]122,122[ ] [ ] [ ] [ ]118,117[ ] [ ]122[ ]122,123[ ] [ ]133,132[ ] ,121[ ] [ ] [ توليد سلول هاي بنيادي جنيني 1. توليد سلول هاي بنيادي القايي 2. استخراج سلول هاي مزانشيمي مغز استخوان 3. سلول هاي بنيادي هماتوپوئيتيک 4. باز برنامه ريزي مستقيم سلول هاي سوماتيک به سلول هاي بنيادي عصبي 5. باز برنامه ريزي مستقيم آستروسيت هاي مغزي به پيش ساز هاي عصبي 1. توليد سلول هاي پيش ساز عصبي از سلول هاي پرتوان ( جنيني و القايي( 4. توليد سلول هاي پيش ساز اليگودندروسيت از سلول هاي پرتوان) جنيني و 8. القايي( 3. توليد و جداسازي سلول هاي پيش ساز دوپامينرژيک 11. تمايز سلول هاي مزانشيمي به سلول هاي شبه عصبي 11. تمايز سلول هاي مزانشيمي به سلول هاي شبه اليگودندروسيتي 12. پيوند سلول هاي مزانشيمي به مدل هاي حيواني بيماريهاي نورودژنرتيو 13. پيوند سلول هاي پيش ساز عصبي به مدل هاي حيواني بيماريهاي نورودژنرتيو 14. پيوند سلول هاي بنيادي مزانشيمي به بيماري هاي نورودژنرتيو در انسان 48

49 7- کاربردهاي فناورانه سلولهاي بنيادي در علوم شناختي 1-7- کاربرد در تکنولوژي ميکروفلوئيدي براي مطالعات علوم اعصاب شناختي نياز به بهره جستن از روشها يا ساختارهايي که بتواند وضعيت و ارتباطات سلولها را با معماري مشابه بافت و اندام شبيه سازي از اهميت بااليي نمايد برخوردار است. استفاده از تکنولوژي ميکروفلوئيدي (Microfluidics) به عنوان بهترين انتخاب معرفي مي شود. کنترل دقيق عبور و مرور محلولها بر روي تراشه هايي از جنس پليمر هاي ويژه انجام مي گردد که داراي کانالها و فضاهايي در ابعاد ميکرومتر بوده و -145[ مي توان به وسيله آنها ورود و خروج محلوها و گازهاي ويژه را به داخل اين فضاها کنترل نمود. از جمله مزاياي اين روش دست يا يب به شبيه سازي حداکثر شرايط رشد و نموي و فيزيولوژيکي.]151-1.]143[ بدن يک موجود زنده مي باشد. سيستم هاي اصلي ويژگي دو ميکروفلوئيدي عبارت اند از: جريان المينار مايعات که نسبت به جريان آشفته در محيط هاي کشت معمولي استرس فيزيکي کمتري به سلولها وارد مي 2- شود. خاصيت موئينگي مسير حرکت محلولها که بر اساس آن محلولها به ويژه در ريزکانالهاي آ يب محلولهاي سيستم مذکور به صورت خودکار و با شدت و سرعت مشخصي مي جريان يابند ]151[. در اين سيستم ها همچنين مي توان ورود برخي فاکتورها و عوامل تنظيم کننده رشد و نموي را بر اساس پارامتر هاي زماني-مکاني تحت کنترل قرار داد. تکنولوژي ميکروفلوئيدي با دو رويکرد (Lab-on-a-chip) گردد: مي استفاده ک يل الف( آزمايشگاه- تراشه ر ي-و تراشه ر ي-و ب( اندام- و.(Organ-on a chip) در روش اول مي توان آزمايشات بيولوژيک را بر روي يک تراشه با هزينه بسيار کم و با سرعت و دقت بااليي انجام داد. در روش اندام روي يع ين دوم هدف اصلي تراشه باز سازي شرايط ويژه رشد و نموي و فيزيولوژيکي سلولها در بستر بافت ها مي باشد. اين مسأله در مورد مطالعات انساني با توجه به محدوديت کار روي انسان و بافتهاي انساني اهميت زيادي دارد. بخش عمده اين ساختار ها جهت باز سازي وضعيت 43

50 يا فشار هيدروديناميک موجود در ميکرو محيط سلولها مي باشد. به اين معني که در پيرامون سلولها يک گردش دائمي از مواد محلول در آب وجود دارد که با فشار و سرعت معيني در جريان مي باشد که باعث به وجود آمدن فشار هيدروديناميک مي گردد. منشأ اين فشار از گردش خون درون رگها مي باشد که مايعات به طور دائم از خون به داخل محيط بافتي و از بافت به داخل رگهاي عبور مي لنفاوي کنند و اين حالت باعث گردش منظم و هماهنگ مواد غذايي گازهاي تنفسي و همچنين فاکتورهاي تنظيم کننده مي گردد. به طور کل هدف نهايي از اين تکنولوژي رويکرد انسان-بر روي-تراشه (Humman-on-chip) مي باشد که اين رويکرد نهايي با تجميع تراشه هاي اندامي انساني با يکديگر ميسر مي شود ]152[. Cohen در سال 2111 و همکاران توانستند با بخش بخش کردن تراشه ميکروفلوئيدي امکان زوائد سلولي جايگيري در بخشي جدا از جسم سلولي را فراهم آورند. مزيت اين مطالعه بر اين بود که ميتوان تأثير محرکي را بر روي زوائد نورونها مورد بررسي قرار داد بدون آنکه جسم سلولي نورونها متأثر گردد ]153[. در سال 2111 و همکارانش هم سلولهاي کشتي آستروسيتي را و نورورني Majumdar انجام دادند. در اين مطالعه دو محفظه مجزا براي نورون و آستروسيت بر روي تراشه تعبيه گرديده و کانالهاي دوطرف از طريق کانالهاي رابط با قطر بسيار کم به هم مربوط مي گشتند که اين ارتباط براي رسيدن زوائد نورونها و آستروسيت ها به همديگر مي باشد تا بر همکنش آنها اتفاق بيفتد )شکل- 1 (.]154[ 51

51 شکل 2- ساختار ميکروفلوئيدي که نورونها و آستروسيت ها در دو رديف موازي ارتباط آنها فقط از طريق زوائد صورت مي گيرد هم کشت داده شده اند ولي.]154[ استفاده از سلولهاي بنيادي انساني يا القايي و پرتوان جنيني و تمايز جهت دار آنها روي تراشه به همراه طراحي ه يا خالقانه از مسيرها جريان محيطهاي کشت و حوضچه هاي کشت انواع سلول زمينه الزم براي مطالعات جديد و اختصاصي انسان را فراهم کرده است. استفاده از سلولهاي در القايي بنيادي بستر اين تکنولوژي امکان مطالعه مکانيزم بيماريه يا خاص عصبي و بازسازي اختصاصي عصبي مدارهاي درگير در فعاليت هاي مغزي از جمله فعاليت هاي شناختي را فراهم آورده است تا بتوان ارتباط مستقيم بين اختالالت عصبي رفتارهاي جمعي نورونها عملکرد نورون و مولکولها و ژنها را تبيين نمود. يکي که از آنجايي از معضالت جدي در حوزه بيماري ه يا انساني دسته بيماري تحليل برنده ه يا عصب مي باشند لذا مطالعه و ارائه راهکار هاي مناسب درماني در اين حوزه از اهميت بسيار مهمي برخوردار مي باشد. با توجه به اينکه مزيت هاي تکنولوژي ميکروفلوئيدي در مطالعات علوم سلولي به طور کامل شناخته شده است لذا محققين علوم اعصاب در اين حوزه نيز به بهره گيري از اين تکنولوژي رو 51

52 آورده اند. در سال 2111 Kunze و همکارانشان نشان دادند که امکان مدلسازي بيماري آلزايمر بر روي تراشه ميکروفلوئيدي وجود دارد. در اين مطالعه نشان داده شد که مي توان همزمان دو گروه نورونهاي بيمار و سالم را بدون اينکه از يک محيط مشترکي تغذيه شوند از طريق زوائد دندريتي با هم و آکسوني مرتبط ساخت ]155[. با توجه به اين که سيستم عصبي يکي از پيچيده ترين ساختارهاي بدن محسوب مي شود و مطالعه بر روي اين سيستم در حيوانات مدل نمي تواند نتايج خوبي را براي تعميم به انسان تعميم ارائه دهد و از طرفي نيز با توجه به نتايج ارزشمندي که در خصوص کاربرد تکنولوژي ميکروفلوئيدي در حوزه علوم اعصاب به دست آمده است مي توان اميدوار بود که با تجميع اين فناوري و فناوري سلولهاي بنيادي انساني امکان باز سازي پيچيدگيه يا سيستم عصبي انسان به ساده ترين شکل ممکن بر روي تراشه هاي ميکروفلوئيدي وجود داشته تا بتوان عالوه بر اينکه مکانيزمه يا مختلف رفتارهاي رشد و نموي و فيزيولوژيکي سلولها را مطالعه مي شود بيماريه يا مختلف درگير کننده سيستم عصبي از جمله بيماريه يا تحليل برنده عصب را بر روي اين ساختارها باز سازي کرد. فناوري و القايي بنيادي سلولهاي امکان تهيه سلولهاي اختصاصي هر بيمار امکان مطالعه اختصاصي هر بيمار و طراحي درمان مختص او را فراهم ساخته است. مي توان در تراشه بهترين دارو و بهترين غلظت براي درمان هر بيمار را بررسي و انتخاب کرد. همچنين مي توان با تمايز سلولهاي در مداري انساني بنيادي از پيش تعيين شده مدارهاي مغزي مانند مدار هيپوکمپ را باز سازي نمود و نحوه پردازش اطالعات در مدارها را بررسي نمود. روشه يا فعلي بيشتر در تالش است پردازش اطالعات در سطح سلول و سيناپس ها را بررسي کند کاربرد در مهندسي رفتار و کنترل ذهن مهندسي رفتار انسانها و کنترل ذهن آنها از ديرباز يکي از موضوعات مورد عالقه دانشمندان و سياستمداران بوده است و پروژههاي متعددي در نقاط مختلف دنيا اغلب به منظور استفاده نظامي طراحي 52

53 و انجام شده است. با توجه به بحثهاي امنيتي اين پروژهها اطالعات زيادي از جزييات آنها در دست 41 نيست. اين دسته از مطالعات که در مواردي قدمت 11 يا ساله دارند از روشهاي مختلف زيستي مهندسي اطالعاتي و... براي نيل به اهداف خود استفاده کردهاند. با توجه به نو بودن بحث سلولهاي بنيادي و توانايي اين تکنولوژي در توليد سلول بافت و اندامي خاص با ويژگيهاي مورد نظر پيشبيني ميشود که انقالبي در اين حوزه به واسطه ورود تکنولوزي سلولهاي بنيادي حاصل گردد و به اين دسته از مطالعات سرعت بخشد برنامه کنترل ذهن سازمان CIA اين پروژه از ابتداي دهه 1351 با هدف مهندسي رفتار انسانها توسط بخش علمي CIA شروع شد و با نام پروژه MKUltra شناخته مي شود. تحقيقات در اين پروژه در راستاي ابداع روشهاي شيميايي زيستي و راديولوژيکي بود که بتوانند رفتار انسانها را کنترل کنند. در اين پروژه 81 موسسه علمي شامل 44 کالج و دانشگاه به همراه بيمارستانها زندانها و شرکتهاي دارويي جهت انجام تحقيقات مهندسي رفتار تحت پوشش قرار گرفتند. اين موسسات تحقيقات خود را با استفاده از مواد شيميايي و داروها )خصوصا )LSD هيپنوتيزم اختالل در عملکردهاي حسي ايزوله کردن افراد سواستفادههاي جنسي و کالمي و همينطور انواع شکنجهها انجام داد. اين گونه تحقيقات همانگونه که از محتواي روش شناسي آن مشخص است در قالبهاي اخالقي شناخته شده تحقيقات آزمايشگاهي و انساني نمي گنجد. پيوند سلولهاي بنيادي مهندسي شده به نمونه هاي مطالعاتي در اين گونه آزمايشات مي تواند را جديدي کنترل براي ذهن و رفتار باز کند. جنبه هاي حيو يان اين گونه مطالعات مي نو براي تواند روشي کنترل مغز در حيوانات باشد. از جمله اهدافي که براي اين پروژه تعريف شده بود عبارت است از: برقراري امنيت در سازمانها 53

54 افزايش کارايي در سازمانها حل مشکالت اداره زندانها درک شرايط اقامت طوالني مدت انسان در فضا پروژه )Defense Advanced Research Projects Agency( DARPA از جمله آژانسهاي تحقيقاتي است که هدف اصلي آن حمايت از پروژههايي است که با DARPA هدف توليد روشهايي براي مهندسي ذهن طراحي شدهاند. در اين مطالعات با کمک تحريک مغناطيسي از خالل جمجمه (TMS) و يا روشهاي ديگر از راه دور ذهن افراد کنترل مي شود طرف آقاي از سال آوريل در که است آژانسي سه از يکي رئيس جمهور اوباما DARPA Brain Research through Advancing آمريکا مستحق طريق کارگروه از مالي حمايت دريافت به دو گروه تنها آژانس اين شد. حدود تحقيقاتي (BRAIN) Neurotechnologies Innovative 34,5 ميليون دالر اعتبار جهت بررسي چگونگي تشکيل حافظه بازيابي آن و توليد ابزارهايي براي تحريک شناخت داد. حافظه در موثر فرايندهاي تحت را انسان مغز عملکرد ميتوان آن کمک به که روشهايي اولويتهاي از داد قرار کنترل است اخير سال چند در 154[. با اين منظور از,151[ اصلي DARPA روشهاي متعددي در اين دسته از تحقيقات استفاده شده است. TMS يک روش درماني موثر براي درمان نقصهاي عملکردي مغز افراد است که در آن لب آهيانه مغز را به کمک ميدانهاي الکترومغناطيسي تحريک ميکنند. از اين روش و ساير روشهايي که قابليت درماني دارند در DARPA جهت اهداف نظامي استفاده ميشود. گروههاي تحقيقاتي مناطقي از مغز را که در ارتباط با عملکردهاي شناختي و درک مطلب است را مشخص کرده و سعي ميکنند کار اين مناطق را مختل کنند و از اين طريق عملکرد قسمتهاي مختلف مغز را شناخته و سپس براي کنترل عملکرد آنها دست به کار شوند. از 54

55 ديگر روشهاي مورد استفاده به اين منظور کاشت الکترود در مغز افراد است تا به اين ترتيب حاالت و 5 رفتار آنها به کنترل درآيد. در مطالعهاي که گروه Talwar و همکارانش انجام دادند در مغز موش صحرايي الکترودي جايگذاري کردند. در يکي از اين موارد الکترود در قسمت مياني جلوي مغز کاشته شد و به اين ترتيب احساس پاداش در حيوان قابل القا بود. در دو حيوان ديگر الکترودها در مناطقي از مغز کار گذاشته شدند که حرکت سبيلهاي موش را کنترل ميکردند. با کمک اين الکترودها و تحريک آنها رفتار موشها تحت کنترل محققان درميآمد ]158[. در اين دسته از پروژهها ميتوان از سلوله يا بنيادي نيز استفاده کرد. تا مدتهاي زيادي سلولهاي بنيادي جنيني به عنوان منبع سلولي براي اهداف بيوتکنولوژيک و درماني استفاده ميشد اما اين روش با محدوديتهاي آزمايشگاهي و اخالقي زيادي همراه بود. با استفاده از روش بازبرنامهريزي اين امکان وجود دارد که سلولهاي تخصصي فرد را به سلولهاي پرتوان القايي )ipsc( تبديل کرده و سپس تمايز آنها را به سلولهاي مورد نياز هدايت نمود ]4[. به اين ترتيب امکان توليد سلولهاي جديد براي اهداف درماني و پژوهشي به وجود آمد. جالب اينجاست که ميتوان اين سلولها را از نظر ژنتيکي مهندسي نمود و سپس با تمايز به بافت يا اندام مورد نظر ويژگيهايي را به آن اعطا نمود. امروزه با معرفي سلولهاي بنيادي القايي پيشرفت چشمگيري در اين زمينه اتفاق افتاده است. تکنولوژي بودن نو به توجه با سلولهاي مهندسي زمينه در فناوري و علم عرصه در بنيادي ذهن و پروژههاي اخير سال چند در رفتار برخوردار نيز خوبي مالي حمايت از و شده تعريف متعددي شدهاند ] [. در اين دسته از تحقيقات با استفاده از سلولهاي بنيادي جنيني يا سلولهاي بنيادي پرتوان القاشده بافت يا اندام مورد نظر توليد شده و به فرد مورد نظر پيوند ميشود. در صورتي که در اين بافت يا اندام مهندسي شده ويژگي خاصي ايجاد شده باشد امکان هدايت عملکرد بخشي از مغز و رفتار افراد به دست ميآيد. اين کار در گذشته با استفاده از چيپهاي الکترونيکي انجام ميشده است اما امروزه ميتوان 55

56 .]112[ با استفاده از سلولهاي بنيادي به اين يافت دست مهم براي توليد انواع اندامهاي بدن انسان با استفاده از سلولهاي بنيادي در محيط آزمايشگاه و بررسيهاي مکانيستيک روي آنها مطالعهاي در دانشکده مهندسي زيستي دانشگاه MIT در حال انجام است. محققين اين دانشکده از يک حمايت مالي به ميزان 32 ميليون دالر از سوي DARPA و NIH بهرهمند شدهاند تا با استفاده از تکنولوژي سلول- هاي بنيادي اندامهاي مختلف انسان را در آزمايشگاه توليد کرده و به مطالعه عملکرد آنها بپردازند. در مرحله بعد اندامهايي مهندسيشده توليد کنند که ويژگي خاصي در آن ايجاد شده است. به اين ترتيب اين گروه ميخواهند که مغزي توليد کنند که مهندسي شده است و داراي ويژگيهاي خاصي است فناوري اپتوژنتيک و کنترل مغز با نور جهت توليد ويژگي خاص در سلولهاي بنيادي و فعال کردن اين ويژگي در زمان و مکان مورد نظر يکي از کارآترين ابزارها تکنولوژي اپتوژنتيک است. اپتوژنتيک تکنولوژي است که در آن از نور و ابزارهاي ژنتيکي براي کنترل سلولها و اندازهگيري فعاليت نورونها در مدارهاي عصبي استفاده ميشود. به مدد اين تکنيک سواالت مهمي که تا به امروز امکان پاسخگويي به آنها وجود نداشته است قابل بررسي و مطالعه شدهاند. تکنولوژي اپتوژنتيک اين امکان را فراهم آورده است که يک جزء از مدار نوروني را بدون دستکاري ساير عوامل با دقت باالي مکاني و زماني تغيير داده و نتيجه را مورد مطالعه قرار داد ]113[. در مطالعات اپتوژنتيک از يک کانال کاتيوني غير اختصاصي به نام Channelrhodopsin-2 (ChR2) استفاده ميشود که با نور آبي فعال ميشود. ژن اين کانال را ميتوان در نورونها وارد و بيان کرد و با استفاده از نور آنها را دپوالريزه و فعال کرد ]114[. امروزه از انواع کانالهاي يوني و پمپهاي مختلفي استفاده ميشود که ميتوانند با طول موجهاي مختلف فعال شده و سلول را تحريک يا مهار

57 و )Archaerhodopsin کنند )شکل 3(. استفاده از اپسينهاي تحريکي و مهاري Halorhodopsin( اين امکان را بوجود آورده که اغلب مدارهاي عصبي را با استفاده از نور ليزر مورد مداخله قرار داده و عملکرد آنها را بررسي کرد ]115[. استفاده از تکنولوژي اپتوژنتيک به دليل قابليتهاي آن در مطالعه فرآيندهاي شناختي و بيماريهاي رواني اهميت ويژهاي پيدا کرده است. از کارهاي اخيري که با کمک اپتوژنتيک انجام شده است ميتوان مطالعات متعددي اشاره کرد که به تشريح نقش آميگدال هيپوکامپ و نئوکورتکس در تشکيل حافظه ترس پرداختهاند ]111[. با استفاده از تکنيک اپتوژنتيک و با تاباندن نور ميتوان در عملکردهاي مغزي و شناختي موجودات تغييراتي ايجاد کرد. در مطالعهاي نشان داده شده است که تحريک نوري کورتکس حرکتي مغز موش بالفاصله باعث فعاليتهاي حرکتي در اين حيوان ميشود ]114[. همچنين نشان داده شده است که مي- توان با تحريکات نوري نورونهاي کليدي موثر در واکنشهاي رفتاري از جمله عادت ]118[ خواب ]111[ ]113[ پاداش و اعتياد ]141[ و ترس و اضطراب رفتار موجودات را کنترل نمود. با وجود پيشرفتهايي که در اين زمينه در جوندگان صورت گرفته است گزارشهاي چنداني از تغيير رفتار پريماتها با کمک تکنيک اپتوژنتيک وجود ندارد اما مطالعات در اين زمينه در حال انجام است ]141[. بعنوان مثالي ديگر با وجود اينکه بسياري از رفتارهاي خشن به هيپوتاالموس مربوط ميشوند اما اينکه دقيقا کدام نورونها و مسيرهاي عصبي مسئول چنين رفتارهايي هستند کامال مشخص نيست. با استفاده از تکنولوژي اپتوژنتيک اين مسئله مورد مطالعه قرار گرفت و دستهاي از نورونهاي مسئول رفتارهاي خشن شناسايي شدند ]142[. 54

58 شکل 3- مراحل اصلي و نحوه ايجاد زير ساخت مطالعات اپتوژنتيک. اصلي ترين مراحل ساخت سازه ژني آماده شدن آن به شکل ذرات ويروسي تزريق آن به ساختار مغزي مورد مطالعه تحريک نوري و فعاليت کانال و در نتيجه فعال سازي يا مهار ساختار عصبي مورد نظر است. 58